【正文】 的后續(xù)序列的核苷酸組成 SD與起始密碼之間的距離 mRNA SD ? 融合型表達載體： 融合蛋白 ? 非融合型表達載體： 天然完整蛋白 ? 分泌型表達載體： 產物可跨膜分泌至胞周間隙 原核表達載體的類型 融合型表達載體 P SD Foreign DNA 融合型表達載體 融合基因 優(yōu)點： ? 表達效率高 ? 產物穩(wěn)定 ? 易鑒定：融合蛋白分子量大，電泳可鑒定 ? 易純化：利用融合原核多肽的特性 技術關鍵： 克隆基因插入原核序列 3’端而維持正確閱讀框架。 ? 選擇合適酶切位點 ? 加人工合成的 DNA接頭 ? 構建位相載體 位相載體 含有 3種讀碼框的系列載體 ? Ptac： IPTG誘導 ? GST融合蛋白 —直接純化 ? 產物切割方便： pGEX1?T—凝血酶 pGEX2T凝血酶 pGEX3TX因子 ? 位相載體 融合型載體 pGEX系列 非融合型表達載體 P SD Foreign DNA 非融合型表達載體 非融合基因 主要元件：強啟動子 SD： ATG：第一個密碼子 非融合型表達載體 pPLLamda PL啟動子 溫度誘導 插入位點 HpaI 分泌型表達載體： ? 主要元件： 啟動子和 SD序列 信號肽序列 ： SD下游，編碼信號肽，可引導蛋白跨膜 ? 優(yōu)點：分泌表達，避免降解。 分泌型表達載體 pINIIIompA1 ? 沒有真核轉錄后加工的功能，不能進行 mRNA的剪接，所以只能表達 cDNA而不能表達真核的基因組基因； ? 沒有真核翻譯后加工的功能，表達產生的蛋白質，不能進行糖基化、磷酸化等修飾，難以形成正確的二硫鍵配對和空間構像折疊，因而產生的蛋白質常沒有足夠的生物學活性； ? 表達的蛋白質經常是不溶的，會在細菌內聚集成包涵體（ inclusion body），尤其當表達目的蛋白量超過細菌體總蛋白量 10%時，就很容易形成包涵體。生成包涵體的原因可能有是蛋白質合成速度太快，多肽鏈相互纏繞，缺乏使多肽鏈正確折疊的因素，導致疏水基因外露等。細菌裂解后，包涵體的離心后的沉淀中，雖然有利于目的蛋白的初步純化，但無生物活性的不溶性蛋白，要經過復性（ renaturation），使其重新散開、重新折疊成具有天然蛋白構象和良好生物活性的蛋白質，常常是一件很困難的事情。也可以設計載體使大腸桿菌分泌表達出可溶性目的蛋白，但表達量往往不高。 原核表達系統(tǒng)的缺點 ? 具轉錄后加工系統(tǒng) ? 具翻譯后修飾系統(tǒng) ? 可實現真正的分泌表達 ? 基因治療 真核表達系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢 真核基因結構及表達調控特點 真核基因組的復雜性： ? 真核基因組龐大，具大量非編碼序列 mRNA豐度不同 ? 結構復雜：染色質、核膜、線粒體 表達調控多樣 ? 不連續(xù)性：內含子、外顯子 ? 沒有操縱子結構 據受體細胞及表達載體的不同分為 3種： ? 酵母表達系統(tǒng) ? 哺乳動物細胞表達系統(tǒng) ? 昆蟲細胞表達系統(tǒng) 要表達真核生物的蛋白質，采用真核表達系統(tǒng)自然應比原核系統(tǒng)優(yōu)越。真核表達載體至少要含兩類序列： ? 原核質粒的序列 ，包括在大腸桿菌中起作用的 復制起始序列 、能用在細菌中篩選克隆的 抗藥性基因標志 等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大腸桿菌系統(tǒng)中篩選獲得目的重組 DNA克隆、并復制繁殖得到足夠使用的數量。 ? ②在真核宿主細胞中表達重組基因所需要的元件，包括 啟動子、增強子、轉錄終止和加 polyA信號序列、 mRNA剪接信號序列、能在宿主細胞中復制或增殖的序列，能用在宿主細胞中篩選的標志基因、以及供外源基因插入的單一限制性內切酶識別位點等。 真核表達載體 真核表達元件： ? 啟動子 /增強子 ? 克隆位點 ? 終止信號和加poly(A)信號 ? 剪接識別信號 ? 復制與選擇元件 外源基因的表達： ? 胞內表達 ? 分泌表達：在 MCS前加入信號肽序列 缺點 : ? 不能實現全部的翻譯后修飾功能 Example IPTG T7 RNA pol His6 cDNA Calreticulin as an example (Calreticulin is an ER chaperone) 鈣網蛋白 calreticulin 內質網中的一種需 Ca2+的凝集素樣分子伴侶蛋白 (inhibits T7 pol) Inducibility in E. coli: via T7 RNA polymerase an inducible OFF ON + IPTG Lac repressor Lysozyme To squelch background low level of T7 pol calreticulin Lac repressor Lac repressor gene (petes with his) Purification of the cloned gene product (Nitriloacetic acid chelate, NTA) MBP = maltose binding protein GST = glutathioneStransferase Assorted protein tags used for purification (binds to biotin site) (Gets biotinylated in vivo) (Ampresistance) (IgGbinding domain from Protein A) Enterokinase: Asp Asp Asp Asp Lys …… OR Tag removal after purification OR TEV protease (tobacco etch virus): GluXXTyrXGlnSer 目的蛋白的分離純化 親和柱 分子篩 離子交換 疏水層析 抗原抗體 目的蛋白 基因載體 目的基因 質粒 噬菌體 病毒 PCR cDNA 人工合成 基因文庫 限制性內切酶 有切口的載體 有切口的目的基因 DNA連接酶 重組體 轉化 轉染 體外包裝 帶重組體的宿主細胞 表型篩選 電泳法 核酸雜交 免疫學方法 目的基因的表達 演講完畢，謝謝觀看！