【正文】 外源基因需要一些基本要素 來自真核細(xì)胞目的基因需要改造 必須選擇用大腸桿菌載體 注意目的基因連接在起始密碼子之后：表達(dá)產(chǎn)物有融合蛋白 和非融合蛋白兩種（ NdeⅠ ： CATATG； NcoⅠ ： CCATGG） 選擇適當(dāng)?shù)氖荏w菌株和誘導(dǎo)條件 融合蛋白較穩(wěn)定； 如果載體攜帶的一段編碼信號肽的基因片段，可產(chǎn)生分泌型產(chǎn)物； ３、可利用融合蛋白中原核蛋白制備的單抗進(jìn)行親和層析，便于純化； ４、可利用融合蛋白中原核部分與表達(dá)蛋白之間加入的蛋白酶切位點(diǎn)，可切除原核部分。 表達(dá)融合蛋白優(yōu)點(diǎn) ： （二）、提高外源基因表達(dá)水平 提高外源基因表達(dá)水平：啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)；調(diào)整 SD序列 與 ATG之間距離；用點(diǎn)突變的方法改變某些堿基；增加 mRNA的穩(wěn)定性 將細(xì)菌生長與外源基因的表達(dá)在時(shí)間上分開：減輕細(xì)胞的代謝負(fù)荷 采用不同措施提高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性：表達(dá)融合蛋白；采用某種突變菌株；表達(dá)分泌蛋白； 二、真核表達(dá)系統(tǒng) 利用真核細(xì)胞作宿主表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是： ① 真核細(xì)胞能夠識別和除去外源基因中的內(nèi)含子，剪接加工形成成熟的 mRNA。 ② 真核細(xì)胞將表達(dá)的蛋白糖基化，而大腸桿菌表達(dá)的蛋白是沒有糖基化的，糖基化對某些表達(dá)蛋白的免疫原性影響很大。 真核細(xì)胞作宿主表達(dá)系統(tǒng)尚存在以下幾個(gè)問題： ① 選擇標(biāo)記及選擇系統(tǒng)只有少數(shù)幾個(gè)； ② 轉(zhuǎn)化效率低，一般只有 106～ 104； ③ 外源基因轉(zhuǎn)移并整合到細(xì)胞染色體 DNA上帶有一定的 自發(fā)性和盲目性 ，整合的拷貝數(shù)和位置都還不能控制； ④ 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞的挑選要求比較高，手續(xù)繁瑣費(fèi)時(shí)。此外，細(xì)胞大量培養(yǎng)還有不少問題，而且成本較高，利用培養(yǎng)細(xì)胞方式大量生產(chǎn)某些表達(dá)蛋白，從工藝到成本都要很好地考慮。 ?受體菌條件： 安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷 處于感受態(tài) (petent) ?導(dǎo)入方式： 轉(zhuǎn)化 (transformation) 轉(zhuǎn)染 (transfection) 感染 (infection) （四）重組 DNA導(dǎo)入受體菌 1. 直接選擇法 (1) 抗藥性標(biāo)記選擇 (2) 標(biāo)志補(bǔ)救 (marker rescue) (3) 分子雜交法 原位雜交 Southern印跡 2. 免疫學(xué)方法 如免疫化學(xué)方法及酶免檢測分析等 （五）重組體的篩選 (插入失活法) 抗藥性標(biāo)記選擇 α互補(bǔ) 利用 α互補(bǔ)原理篩選重組體 pUC18 原位雜交 Southern印跡 雞的 β肌球蛋白的克隆和檢出 免疫學(xué)方法 重組 DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為： 小結(jié) 分 分離目的基因 切 限制酶切目的基因與載體 接 拼接重組體 轉(zhuǎn) 轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞 篩 篩選重組體 重組 DNA技術(shù)操作的主要步驟 載體 質(zhì)粒 噬菌體 病毒 目的基因（外源基因） 基因組 DNA cDNA 人工合成 PCR產(chǎn)物 限制酶消化 開環(huán)載體 DNA 目的基因 連接酶 重組體 轉(zhuǎn)化 體外包裝，轉(zhuǎn)染 帶重組體的宿主 篩選 表型篩選 酶切電泳鑒定 菌落原位雜交 表達(dá)體系的建立： ? 表達(dá)載體的構(gòu)建 ? 受體細(xì)胞的建立 ? 表達(dá)產(chǎn)物的分離純化 （六）克隆基因的表達(dá) ? 標(biāo)準(zhǔn)： 選擇標(biāo)志 強(qiáng)啟動(dòng)子 翻譯調(diào)控序列 多接頭克隆位點(diǎn) ? ： 不宜表達(dá)真核基因組 DNA； 不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)； 表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體 (inclusion body) ； 很難表達(dá)大量可溶性蛋白。 1. 原核表達(dá)體系 ( ) 大鼠胰島素原 cDNA 的表達(dá)和分泌 ? 優(yōu)點(diǎn)： 可表達(dá)克隆的 cDNA及真核基因組 DNA 可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì) 表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累 ? 缺點(diǎn)： 操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、經(jīng)濟(jì) ? 轉(zhuǎn)染 —— 將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程 方法： 磷酸鈣轉(zhuǎn)染 DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染 電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 顯微注射 （酵母、昆蟲、乳類動(dòng)物細(xì)胞） 表達(dá)載體 pFASTBACI 的物理圖譜 表達(dá)載體 YEpI PT的物理圖譜 第三節(jié) 重組 DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué) 的關(guān)系非常密切并前景遠(yuǎn)大 DNA Rebination Technique is Closly Related with Medicine and has a Good Perspective 一、疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆 根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質(zhì)，而認(rèn)識疾病的分子機(jī)制。 ? 疾病基因發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)典型例子 : 脆性 X綜合征 Kallmann綜合征 二、生 物制藥 ?利用基因工程生產(chǎn)有藥用價(jià)值的蛋白質(zhì)、多肽產(chǎn)品已成為當(dāng)今世界一項(xiàng)重大產(chǎn)業(yè)，并將有望成為 21世紀(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)。 ?美國 Eli Lilly公司于 1982年首先利用重組DNA技術(shù)合成人胰島素并投放市場，標(biāo)志著生物工程藥物時(shí)代的開始。迄今為止，已有50多種基因工程藥物上市，近千種處于研發(fā)狀態(tài)，形成一個(gè)巨大的高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)，產(chǎn)生了不可估量的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。 重組 DNA醫(yī)藥產(chǎn)品 產(chǎn) 品 功 能 組織胞漿素原激活劑 抗凝 血液因子 VIII 促進(jìn)凝血 顆粒細(xì)胞 巨噬細(xì)胞集落剌激因子 剌激白細(xì)胞生成 促紅細(xì)胞生成素 剌激白細(xì)胞生成 生長因子 (bFGF, EGF) 刺激細(xì)胞生長與分化 生長素 治療侏儒癥 胰島素 治療糖尿病 干擾素 (? 1b, ?2a, ? 2b, ?) 抗病毒感染及某些腫瘤 白細(xì)胞介素 激活、剌激各類白細(xì)胞 超氧化物歧化酶 抗組織損傷 單克隆抗體 利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診斷試驗(yàn)、腫瘤導(dǎo)向治療 乙肝疫苗 (CHO, 酵母 ) 預(yù)防乙肝 口服重組 B亞單位菌體霍亂菌苗 預(yù)防霍亂 基因診斷 (geic diagnosis)是 利用分子生物學(xué)及分子遺傳的技術(shù)和原理 ， 在DNA水平分析 、 鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換 、 缺失或插入等突變 。 又稱DNA診斷 。 三、基因診斷與治療 （一）基因診斷的概念 ?基本過程： 區(qū)分或鑒定 DNA的異常 分離、擴(kuò)增待測的 DNA片斷 ? 能正確擴(kuò)增靶基因； ? 能準(zhǔn)確區(qū)分單個(gè)堿基的差別； ? 本底或噪聲低，不干擾 DNA的鑒定 。 ? 便于完全自動(dòng)化操作，適合大面積、大人群普查。 ?標(biāo)準(zhǔn)： （二）基因治療的概念 ?定義 基因治療 (gene therapy)是向有功能缺陷的細(xì)胞補(bǔ)充相應(yīng)功能的基因，以糾正或補(bǔ)償其基因的缺陷，從而達(dá)到治療的目的。 ?方式 體細(xì)胞基因治療 (somatic cell gene therapy) 性細(xì)胞基因治療 (germ line gene therapy) 1. 產(chǎn)前診斷 2. 攜帶者測試 3. 癥候前診斷 4. 遺傳病易感性 四、遺傳疾病的預(yù)防 演講完畢，謝謝觀看！