【正文】 0 Kb 外源 DNA 片段 基因文庫mRNA cDNA 雙鏈 cDNA 重組 DNA分子 cDNA文庫 反轉(zhuǎn)錄酶 載體 受體菌 復制3.　 cDNA文庫　 逆轉(zhuǎn)錄酶A A A AT T T T AAAASI核酸酶 DNA聚合酶 Ⅰ堿水解T T T T　　 是一種在體外利用酶促反應大量獲得特異序列的基因組 DNA或 cDNA的專門技術(shù)，又稱為無細胞的分子克隆。4. 聚合酶鏈反應（ PCR）模板 DNA引物4種 dNTPTaq DNA聚合酶含 Mg2+的緩沖液。PCR的反應體系 ?。?1） 變性 ，加熱至 95 ℃ ，使模板 DNA解開成單鏈；（ 2） 退火 ，溫度降至適宜，使引物與模板互補結(jié)合；（ 3） 延伸 ，溫度升至 72 ℃ ， DNA聚合酶以 4種dNTP為底物，在引物的 3’OH上，合成與模板互補的 DNA新鏈。PCR的基本反應步驟及原理 　　　　　　　　　PCR反應條件 　變性95?C延伸72?C退火Tm5?C　 　PCR反應的基本原理（三）外源基因與載體的連接1. 粘性末端連接方式： (1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建Bam HⅠ 切割反應 GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶15186。CGATCC GGCCTAG+目的基因用 Bam HⅠ 切割 載體 DNA用 Bam HⅠ 切割重組體載體自連 目的基因自連同一限制酶切位點連接不同限制酶切位點的連接Eco RⅠ 切割位點 Bg lⅡ 切割位點+EcoRⅠ + Bg lⅡ雙酶切 Eco RⅠ + Bg lⅡ雙酶切T4 DNA連接酶15186。C重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。2. 平端連接適用于： 限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶15186。C重組體 載體自連 目的基因 自連3. 同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶 (terminal transferase)的作用下，在 DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。5180。3180。3180。5180。載體 DNA5180。3180。3180。5180。目的基因限制酶或機械剪切 限制酶 5180。3180。 　 3180。5180?！　　　? 5180。 3180。 T(T)nT T(T)nT 3180。5180。 5180。 3180?！?3180。5180?！　　　　?5180。 3180。 A(A)nA 　 A(A)nA 3180。5180。λ核酸外切酶 λ核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dATP末端轉(zhuǎn)移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶15186。C重組體4. 人工接頭 (linker)連接由平端加上帶有新的酶切位點的接頭，再用限制性酶切產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接。Eco RⅠEco RⅠEco RⅠ人工接頭及其應用CCGAATTCG GGCTTAAGC5180。3180。Eco RⅠ受體菌條件安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài) (petent) 導入方式轉(zhuǎn)化 (transformation)轉(zhuǎn)染 (transfection)感染 (infection)（四）重組 DNA導入受體菌（五）重組體的篩選　 1. 直接選擇法　 (1) 抗藥性標記選擇　 (2) 標志補救 (marker rescue)　 (3) 分子雜交法原位雜交Southern印跡 　 2. 免疫學方法　如免疫化學方法及酶免檢測分析等(插入失活法)抗藥性標記選擇組氨酸缺陷型大腸桿菌無組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進組氨酸合成λDNA重組體標志補救 α 互補的檢測原位雜交Southern印跡雞的 β肌球蛋白的克隆和檢出重組 DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為 小 結(jié)分 分離目的基因 切 限制酶切目的基因與載體接 拼接重組體 轉(zhuǎn) 轉(zhuǎn)入受體菌 篩 篩選重組體 重組 DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒 噬菌體 病毒目的基因（外源基因）基因組 DNA cDNA 人工合成 PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體 DNA 目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化 體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選 酶切電泳鑒定 菌落原位雜交表達體系的建立表達載體的構(gòu)建受體細胞的建立表達產(chǎn)物的分離純化（六）克隆基因的表達1. 原核表達體系 （ ）標準： 選擇標志 強啟動子 翻譯調(diào)控序列 多接頭克隆位點 不宜表達真核基因組 DNA不能加工表達的真核蛋白質(zhì)表達的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體 (inclusion body)很難表達大量可溶性蛋白優(yōu)點： 可表達克隆的 cDNA及真核基因組 DNA可適當修飾表達的蛋白質(zhì)表達產(chǎn)物分區(qū)域積累缺點： 操作技術(shù)難、費時、費錢轉(zhuǎn)染 —— 將表達載體導入真核細胞的過程方法： 磷酸鈣轉(zhuǎn)染DEAE葡聚糖介導轉(zhuǎn)染電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 顯微注射 2. 真核表達體系 酵母、昆蟲、哺乳類動物細胞表達載體 pFASTBACI 的物理圖譜（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質(zhì)，而認識疾病的分子機制。三、重組技術(shù)與醫(yī)學的關系（二）生物制藥 重組 DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn) 品 功 能組織胞漿素原激活劑 抗凝血液因子 VIII 促進凝血顆粒細胞 巨噬細胞集落剌激因子 剌激白細胞生成促紅細胞生成素 剌激白細胞生成生長因子 (bFGF, EGF) 刺激細胞生長與分化生長素 治療侏儒癥胰島素 治療糖尿病干擾素 (? 1b, ?2a, ? 2b, ?) 抗病毒感染及某些腫瘤白細胞介素 激活、剌激各類白細胞超氧化物歧化酶 抗組織損傷單克隆抗體 利用其結(jié)合特異性進行診斷試驗、腫瘤導向治療乙肝疫苗 (CHO, 酵母 ) 預防乙肝口服重組 B亞單位菌體霍亂菌苗 預防霍亂基因診斷 (geic diagnosis)是 利用分子生物學及分子遺傳的技術(shù)和原理，在 DNA水平分析、鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換、缺失或插入等突變。（三）基因診斷基本過程區(qū)分或鑒定 DNA的異常分離、擴增待測的 DNA片斷標準. 能正確擴增靶基因；. 能準確區(qū)分單個堿基的差別；. 本底或噪聲低，不干擾 DNA的鑒定 。. 便于完全自動化操作，適合大面積、大人群普查。（四）基因治療定義基因治療 (gene therapy)是向有功能缺陷的細胞補充相應功能的基因，以糾正或補償其基因的缺陷，從而達到治療的目的。方式體細胞基因治療 (somatic cell gene therapy)性細胞基因治療 (germ line gene therapy)1. 產(chǎn)前診斷2. 攜帶者測試3. 癥候前診斷4. 遺傳病易感性（五）遺傳疾病的預防　　復習思考題：　 1. 概念：（ 1）克隆 （ 2）轉(zhuǎn)化（ 3）轉(zhuǎn)位 （ 4）基因工程（ 5）轉(zhuǎn)座 （ 6）限制性核酸內(nèi)切酶（ 7）載體 （ 8） G文庫（ 9）質(zhì)粒 （ 10） c文庫2. 簡述基因工程的基本過程。3. 簡述目的基因的主要來源或途徑。DNA克隆及相關的基因操作技術(shù)及其應用在后續(xù)章節(jié)專門講授演講完畢，謝謝觀