【正文】 DNA克隆及相關(guān)的基因操作技術(shù)及其應(yīng)用在后續(xù)章節(jié)專門講授演講完畢，謝謝觀看！。方式體細(xì)胞基因治療 (somatic cell gene therapy)性細(xì)胞基因治療 (germ line gene therapy)1. 產(chǎn)前診斷2. 攜帶者測試3. 癥候前診斷4. 遺傳病易感性（五）遺傳疾病的預(yù)防　　復(fù)習(xí)思考題：　 1. 概念：（ 1）克隆 （ 2）轉(zhuǎn)化（ 3）轉(zhuǎn)位 （ 4）基因工程（ 5）轉(zhuǎn)座 （ 6）限制性核酸內(nèi)切酶（ 7）載體 （ 8） G文庫（ 9）質(zhì)粒 （ 10） c文庫2. 簡述基因工程的基本過程。. 便于完全自動化操作，適合大面積、大人群普查。三、重組技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系（二）生物制藥 重組 DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn) 品 功 能組織胞漿素原激活劑 抗凝血液因子 VIII 促進凝血顆粒細(xì)胞 巨噬細(xì)胞集落剌激因子 剌激白細(xì)胞生成促紅細(xì)胞生成素 剌激白細(xì)胞生成生長因子 (bFGF, EGF) 刺激細(xì)胞生長與分化生長素 治療侏儒癥胰島素 治療糖尿病干擾素 (? 1b, ?2a, ? 2b, ?) 抗病毒感染及某些腫瘤白細(xì)胞介素 激活、剌激各類白細(xì)胞超氧化物歧化酶 抗組織損傷單克隆抗體 利用其結(jié)合特異性進行診斷試驗、腫瘤導(dǎo)向治療乙肝疫苗 (CHO, 酵母 ) 預(yù)防乙肝口服重組 B亞單位菌體霍亂菌苗 預(yù)防霍亂基因診斷 (geic diagnosis)是 利用分子生物學(xué)及分子遺傳的技術(shù)和原理，在 DNA水平分析、鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換、缺失或插入等突變。Eco RⅠ受體菌條件安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài) (petent) 導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化 (transformation)轉(zhuǎn)染 (transfection)感染 (infection)（四）重組 DNA導(dǎo)入受體菌（五）重組體的篩選　 1. 直接選擇法　 (1) 抗藥性標(biāo)記選擇　 (2) 標(biāo)志補救 (marker rescue)　 (3) 分子雜交法原位雜交Southern印跡 　 2. 免疫學(xué)方法　如免疫化學(xué)方法及酶免檢測分析等(插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇組氨酸缺陷型大腸桿菌無組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進組氨酸合成λDNA重組體標(biāo)志補救 α 互補的檢測原位雜交Southern印跡雞的 β肌球蛋白的克隆和檢出重組 DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為 小 結(jié)分 分離目的基因 切 限制酶切目的基因與載體接 拼接重組體 轉(zhuǎn) 轉(zhuǎn)入受體菌 篩 篩選重組體 重組 DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒 噬菌體 病毒目的基因（外源基因）基因組 DNA cDNA 人工合成 PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體 DNA 目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化 體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選 酶切電泳鑒定 菌落原位雜交表達體系的建立表達載體的構(gòu)建受體細(xì)胞的建立表達產(chǎn)物的分離純化（六）克隆基因的表達1. 原核表達體系 （ ）標(biāo)準(zhǔn)： 選擇標(biāo)志 強啟動子 翻譯調(diào)控序列 多接頭克隆位點 不宜表達真核基因組 DNA不能加工表達的真核蛋白質(zhì)表達的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體 (inclusion body)Eco RⅠEco RⅠEco RⅠ人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG GGCTTAAGC5180。λ核酸外切酶 λ核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dATP末端轉(zhuǎn)移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶15186。 A(A)nA 　 A(A)nA 3180?！　　　　?5180?！?3180。 5180。 T(T)nT T(T)nT 3180。　　　　 5180。 　 3180。目的基因限制酶或機械剪切 限制酶 5180。3180。載體 DNA5180。3180。5180。2. 平端連接適用于： 限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶15186。CGATCC GGCCTAG+目的基因用 Bam HⅠ 切割 載體 DNA用 Bam HⅠ 切割重組體載體自連 目的基因自連同一限制酶切位點連接不同限制酶切位點的連接Eco RⅠ 切割位點 Bg lⅡ 切割位點+EcoRⅠ + Bg lⅡ雙酶切 Eco RⅠ + Bg lⅡ雙酶切T4 DNA連接酶15186。PCR的反應(yīng)體系 ?。?1） 變性 ，加熱至 95 ℃ ，使模板 DNA解開成單鏈；（ 2） 退火 ，溫度降至適宜，使引物與模板互補結(jié)合；（ 3） 延伸 ，溫度升至 72 ℃ ， DNA聚合酶以 4種dNTP為底物，在引物的 3’OH上，合成與模板互補的 DNA新鏈。T T T T　　 是一種在體外利用酶促反應(yīng)大量獲得特異序列的基因組 DNA或 cDNA的專門技術(shù)，又稱為無細(xì)胞的分子克隆。 DNA文庫 (genomic DNA library)3. cDNA文庫 (cDNA library)4. 聚合酶鏈反應(yīng) (polymerase chain reaction, PCR) 1.　化學(xué)合成法由已知氨基酸序列推測可能的 DNA序列組織或細(xì)胞染色體 DNA基因片段克隆載體重組 DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌　　存在于轉(zhuǎn)化細(xì)菌內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組 DNA的集合2. 基因組 DNA文庫限制酶切位點限制酶消化 除去中間片段cos L R coscos L左臂R cos右臂真核生物染色體 DNA限制酶部分消化 外源 DNA與載體 DNA混合 連接反應(yīng) 體外包裝 用重組噬菌體感染大腸桿菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R cos~20 Kb 外源 DNA 片段 基因文庫mRNA cDNA 雙鏈 cDNA 重組 DNA分子 cDNA文庫 反轉(zhuǎn)錄酶 載體 受體菌 復(fù)制3.　 cDNA文庫　 逆轉(zhuǎn)錄酶A A A A 　　細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)? 能自主復(fù)制；? 具有兩個以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；? 有克隆位點（外源 DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；? 分子量小，以容納較大的外源 DNA。常用載體質(zhì)粒 DNA噬菌體 DNA病毒 DNA克隆載體 (cloning vector)為使插入的外源 DNA序列被擴增而特意設(shè)計的載體稱為 克隆載體 。這兩個相同的粘性