【正文】 真核表達載體 真核表達元件： ? 啟動子 /增強子 ? 克隆位點 ? 終止信號和加poly(A)信號 ? 剪接識別信號 ? 復制與選擇元件 外源基因的表達： ? 胞內表達 ? 分泌表達：在 MCS前加入信號肽序列 缺點 : ? 不能實現(xiàn)全部的翻譯后修飾功能 Example IPTG T7 RNA pol His6 cDNA Calreticulin as an example (Calreticulin is an ER chaperone) 鈣網蛋白 calreticulin 內質網中的一種需 Ca2+的凝集素樣分子伴侶蛋白 (inhibits T7 pol) Inducibility in E. coli: via T7 RNA polymerase an inducible OFF ON + IPTG Lac repressor Lysozyme To squelch background low level of T7 pol calreticulin Lac repressor Lac repressor gene (petes with his) Purification of the cloned gene product (Nitriloacetic acid chelate, NTA) MBP = maltose binding protein GST = glutathioneStransferase Assorted protein tags used for purification (binds to biotin site) (Gets biotinylated in vivo) (Ampresistance) (IgGbinding domain from Protein A) Enterokinase: Asp Asp Asp Asp Lys …… OR Tag removal after purification OR TEV protease (tobacco etch virus): GluXXTyrXGlnSer 目的蛋白的分離純化 親和柱 分子篩 離子交換 疏水層析 抗原抗體 目的蛋白 基因載體 目的基因 質粒 噬菌體 病毒 PCR cDNA 人工合成 基因文庫 限制性內切酶 有切口的載體 有切口的目的基因 DNA連接酶 重組體 轉化 轉染 體外包裝 帶重組體的宿主細胞 表型篩選 電泳法 核酸雜交 免疫學方法 目的基因的表達 演講完畢，謝謝觀看！ 。真核表達載體至少要含兩類序列： ? 原核質粒的序列 ，包括在大腸桿菌中起作用的 復制起始序列 、能用在細菌中篩選克隆的 抗藥性基因標志 等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大腸桿菌系統(tǒng)中篩選獲得目的重組 DNA克隆、并復制繁殖得到足夠使用的數(shù)量。也可以設計載體使大腸桿菌分泌表達出可溶性目的蛋白，但表達量往往不高。生成包涵體的原因可能有是蛋白質合成速度太快，多肽鏈相互纏繞，缺乏使多肽鏈正確折疊的因素，導致疏水基因外露等。 ? 選擇合適酶切位點 ? 加人工合成的 DNA接頭 ? 構建位相載體 位相載體 含有 3種讀碼框的系列載體 ? Ptac： IPTG誘導 ? GST融合蛋白 —直接純化 ? 產物切割方便： pGEX1?T—凝血酶 pGEX2T凝血酶 pGEX3TX因子 ? 位相載體 融合型載體 pGEX系列 非融合型表達載體 P SD Foreign DNA 非融合型表達載體 非融合基因 主要元件：強啟動子 SD： ATG：第一個密碼子 非融合型表達載體 pPLLamda PL啟動子 溫度誘導 插入位點 HpaI 分泌型表達載體： ? 主要元件： 啟動子和 SD序列 信號肽序列 ： SD下游，編碼信號肽，可引導蛋白跨膜 ? 優(yōu)點：分泌表達，避免降解。溫度誘導。 ? Ptac :Lac啟動子和 Trp啟動子的雜合啟動子。 外源基因在原核表達系統(tǒng)中表達的必要條件： ? 刪除內含子和 5’非編碼區(qū) ? 外源基因置于強啟動子和 SD順序控制下 ? 維持正確開放閱讀框架（ ORF） ? mRNA穩(wěn)定且可有效轉譯，形成的蛋白質不被降解 原核表達載體 (expressing vector) ? 特點：帶表達構件 —轉錄和翻譯所需的 DNA序列 ? 大腸桿菌表達載體：含啟動子 —核糖體結合位點 —克隆位點 —轉錄終止信號 ? 啟動子： trplac(tac)啟動子、 λ噬菌體 PL啟動子、T7噬菌體啟動子 ? 核糖體結合位點 (ribosomebinding site,RBS)：起始密碼子 (ATG)和 SD序列 ? 轉錄終止序列 影響外源基因在原核細胞中表達效率的因素： 啟動子 終止子 SD mRNA 多肽鏈 啟動子的選擇和改造 強啟動子 可調控啟動子 P ? 啟動子：建立表達載體時，選擇強啟動子。因此大腸桿菌是目前應用最廣泛的蛋白質表達系統(tǒng)。 ? 原核生物中參與轉錄的基因結構： 啟動子 (promoter, P)是指能被 RNA聚合酶識別、結合并啟動基因轉錄的一段 DNA序列。 ? 原核生物中功能相關的基因串聯(lián)在一起，形成操縱子。 ? 原核生物形成多順反子 mRNA： mRNA在合成過程中和多個核糖體結合，翻譯形成多條肽鏈。這三種核苷酸的合成只能有補償途徑合成，必須具有 tk基因的存在細胞才可生長。 真核細胞的篩選標記 新霉素類藥物 G418篩選 Am Neo P ori G418 滅活 （ ） 蛋白質合成 tk 細胞突變株篩選轉染細胞 選擇原理： ? tk(胸苷激酶 )基因的篩選：受體細胞必須是相應的 tk，將細胞培養(yǎng)在含 HAT（ H：黃嘌呤，A：氨甲喋呤， T：胸苷）的培養(yǎng)基中。 ACTGAAGGCT 真核細胞的篩選 ? 新霉素抗性選擇系統(tǒng)： 新霉素是原核生物的抗生素，對真核生物沒有抑制作用，但新霉素的類似物 G418對真核細胞及原核細胞均具有抑制作用。 ? 32P標記的 DNA分子探針 ? 雜交 ? 放射自顯影法 ? 依據(jù)：堿基互補配對原則 ?