【正文】 D半乳糖苷）的培養(yǎng)基上。 ? 而當(dāng)有外源基因插入到多克隆原點(diǎn)，從而造成插入突變失活，則不能產(chǎn)生 α互補(bǔ)，因此菌落是白色的。 ? IPTG起誘導(dǎo)表達(dá)的作用，相當(dāng)于乳糖，但它的誘導(dǎo)效率遠(yuǎn)高于乳糖。將單一細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增后分別提取其 DNA，用重組時(shí)所用的同一限制酶進(jìn)行酶切，再將其與不含目的基因的載體一起進(jìn)行電泳比較分析，如發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)目的基因片段的電泳帶即證明重組體中帶有目的基因。 雜交篩選法 為了進(jìn)一步鑒定重組基因體中的目的基因，可采用與目的基因部分互補(bǔ)的 DNA片段作為探針，與含有重組體的細(xì)菌菌落進(jìn)行雜交，經(jīng)放射自顯影，如結(jié)果為陽(yáng)性，即可確定重組體中帶目的基因。 分子雜交 免疫化學(xué)檢測(cè)法 濾膜（固定抗體） + DNA序列分析法 ? 該方法通常是用在目的基因篩選后最終的鑒定。新霉素抗性基因（ neo）能在真核細(xì)胞中表達(dá)并能使 G418失活（ neo基因編碼一個(gè)磷酸轉(zhuǎn)移酶），細(xì)胞可以生長(zhǎng)。在 A存在下，核苷酸的從頭合成途徑被阻斷，不能合成 AMP、 TMP及 GMP。 氨基喋呤篩選法 氨基喋呤 (HAT選擇 ) 核酸從頭合成 （ ） 核酸補(bǔ)救合成（ TK酶） TK TK+ DNA重組的基本模式 分（離目的基因） 切（割目的基因和載體） 接（連目的基因和載體） 轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞） 篩（選陽(yáng)性克?。? 表（達(dá)目的基因） “縱向”體系 外源基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá) 重組子 目的基因的 mRNA 表達(dá)蛋白質(zhì) 大腸桿菌（ ） 受體細(xì)胞 外源基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá) 原核生物基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)特點(diǎn) ? 原核生物染色體 DNA是裸露的環(huán)形 DNA，其轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)的連續(xù)進(jìn)行。 ? 一般不含內(nèi)含子（ intron），沒(méi)有轉(zhuǎn)錄及翻譯后加工系統(tǒng)。操縱子是一組功能上相關(guān)，受同一調(diào)控區(qū)控制的基因組成的一個(gè)遺傳單位。一般長(zhǎng) 4060bp，富含 AT堿基對(duì) 具有保守序列： 10區(qū)（ pribnow box）： TATAAT 35區(qū)： 終止子（ terminator， T） :位于基因 3’端 ,給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的 DNA序列 ? 與翻譯有關(guān)的原核細(xì)胞結(jié)構(gòu)： ——核糖體結(jié)合位點(diǎn) 翻譯起始密碼子 AUG 或 GUG SD順序（ shinedalgarno）： AUG上游 311 bp 長(zhǎng)約 39bp mRNA與 16s核糖體亞基間的識(shí)別與結(jié)合序列 人類(lèi)對(duì)大腸桿菌經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的研究，對(duì)其特性和遺傳背景了解得最清楚，大腸桿菌培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)繁殖快、價(jià)格低廉，人們用大腸桿菌用外源基因的表達(dá)工具已有幾十年的經(jīng)驗(yàn)積累，大腸桿菌表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其它基因表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的目的蛋白量甚至能超過(guò)細(xì)菌總蛋白量的 80%。 設(shè)計(jì)外源基因在大腸桿菌表達(dá)就需要外源基因在大腸桿菌中表達(dá)所需要的元件， 包括轉(zhuǎn)錄起始必需的啟動(dòng)子、翻譯起始所必需的核糖體識(shí)別序列 等；外源基因表達(dá)的產(chǎn)物可能會(huì)對(duì)大腸桿菌有毒害作用，會(huì)影響細(xì)菌的生存繁殖，所以大多數(shù)表達(dá)載體都帶有 誘導(dǎo)性表達(dá)所需要的元件 ，即有 操縱子序列以及與之配套的調(diào)控基因 等；外源基因還應(yīng)當(dāng)插入到適合于表達(dá)的位置，所以表達(dá)載體中要設(shè)有適合的 多克隆位點(diǎn) ；此外還應(yīng) 具備基因克隆篩選的條件 ，包括在細(xì)胞中復(fù)制必需的 復(fù)制起始序列、篩選標(biāo)志 如抗藥性基因等。 啟動(dòng)子最佳作用距離 轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn) 常見(jiàn)原核強(qiáng)啟動(dòng)子： ? Plac：受 Lac阻遏蛋白負(fù)調(diào)，受 IPTG的誘導(dǎo) ? Ptrp：取自大腸桿菌色氨酸操縱子。 ? PL和 PR啟動(dòng)子：噬菌體早期左 /右向啟動(dòng)子，受 λ噬菌體 CI基因負(fù)調(diào)控。 Promoters for E. coli ? 終止子： 強(qiáng)終止子、二聚體終止子 終止子 啟動(dòng)子 轉(zhuǎn)錄過(guò)度 影響目的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率 干擾基因載體的復(fù)制等生物學(xué)功能 增加受體細(xì)胞的無(wú)效能量消耗 ? SD序列：影響翻譯效率 SD序列與 16SrRNA的互補(bǔ)性 SD的后續(xù)序列的核苷酸組成 SD與起始密碼之間的距離 mRNA SD ? 融合型表達(dá)載體： 融合蛋白 ? 非融合型表達(dá)載體： 天然完整蛋白 ? 分泌型表達(dá)載體： 產(chǎn)物可跨膜分泌至胞周間隙 原核表達(dá)載體的類(lèi)型 融合型表達(dá)載體 P SD Foreign DNA 融合型表達(dá)載體 融合基因 優(yōu)點(diǎn)： ? 表達(dá)效率高 ? 產(chǎn)物穩(wěn)定 ? 易鑒定：融合蛋白分子量大，電泳可鑒定 ? 易純化：利用融合原核多肽的特性 技術(shù)關(guān)鍵： 克隆基因插入原核序列 3’端而維持正確閱讀框架。 分泌型表達(dá)載體 pINIIIompA1 ? 沒(méi)有真核轉(zhuǎn)錄后加工的功能，不能進(jìn)行 mRNA的剪接，所以只能表達(dá) cDNA而不能表達(dá)真核的基因組基因； ? 沒(méi)有真核翻譯后加工的功能，表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，不能進(jìn)行糖基化、磷酸化等修飾，難以形成正確的二硫鍵配對(duì)和空間構(gòu)像折疊，因而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)常沒(méi)有足夠的生物學(xué)活性； ? 表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)常是不溶的，會(huì)在細(xì)菌內(nèi)聚集成包涵體（ inclusion body），尤其當(dāng)表達(dá)目的蛋白量超過(guò)細(xì)菌體總蛋白量 10%時(shí)，就很容易形成包涵體。細(xì)菌裂解后，包涵體的離心后的沉淀中，雖然有利于目的蛋白的初步純化，但無(wú)生物活性的不溶性蛋白，要經(jīng)過(guò)復(fù)性（ renaturation），使其重新散開(kāi)、重新折疊成具有天然蛋白構(gòu)象和良好生物活性的蛋白質(zhì)，常常是一件很困難的事情。 原核表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn) ? 具轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng) ? 具翻譯后修飾系統(tǒng) ? 可實(shí)現(xiàn)真正的分泌表達(dá) ? 基因治療 真核表達(dá)系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢(shì) 真核基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)調(diào)控特點(diǎn) 真核基因組的復(fù)雜性： ? 真核基因組龐大，具大量非編碼序列 mRNA豐度不同 ? 結(jié)構(gòu)復(fù)雜：染色質(zhì)、核膜、線(xiàn)粒體 表達(dá)調(diào)控多樣 ? 不連續(xù)性：內(nèi)含子、外顯子 ? 沒(méi)有操縱子結(jié)構(gòu) 據(jù)受體細(xì)胞及表達(dá)載體的不同分為 3種： ? 酵母表達(dá)系統(tǒng) ? 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) ? 昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 要表達(dá)真核生物的蛋白質(zhì)，采用真核表達(dá)系統(tǒng)自然應(yīng)比原核系統(tǒng)優(yōu)越。 ? ②在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)重組基因所需要的元件，包括 啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止和加 polyA信號(hào)序列、 mRNA剪接信號(hào)序列、能在宿主細(xì)胞中復(fù)制或增殖的序列，能用在宿主細(xì)胞中篩選的標(biāo)志基因、以及供外源基因插入的單一限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別