基因重組與基因工程技術(shù)課件(存儲版)
【正文】 大并可維持足夠的時間，使外源 DNA進(jìn)入受體細(xì)胞。 ? 向管中加入 1ml LB液體培養(yǎng)基 (不含 Amp)，混勻后 37℃ 振蕩培養(yǎng) 1小時，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài) ,并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因 (Ampr )。細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的 OD600 來控制。 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 ( 化學(xué)方法 ) 大腸桿菌細(xì)胞 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 CaCl2處理 目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法是 CaCl2法 , CaCl2 法簡便易行 ,且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實驗的要求 ,制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時不用時 ,可加入占總體積 15％的無菌甘油于 70℃ 保存(半年 ),因此 CaCl2法為使用更廣泛。 （三）人工接頭連接法： ? 將人工連接器（ linker，即一段人工合成的含有多種限制酶切點的小分子 DNA片段，約 10~20個核苷酸）連接到平末端 DNA分子 (載體和目的基因 )上，即有可能使用同一種限制酶對載體和目的基因進(jìn)行切斷，得到可以互補(bǔ)的粘性末端。 ? 較少的情況下，對產(chǎn)生的平端也可直接進(jìn)行連接。形成粘性末端 (cohesive end)者較有利于載體 DNA和目的基因的重組。 ? 具有 自我復(fù)制 功能。 ? 用途： PCR引物 ,測序引物 ,定點突變 ,核酸雜交探針 從基因文庫中篩選 ? 將某一種基因 DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嗪螅c載體 DNA重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到含全部基因組 DNA的種群，稱為 G文庫 (genomic DNA library)。 科恩隨后以 DNA重組技術(shù)發(fā)明人的身份向美國專利局申報了世界上第一個基因工程的技術(shù)專利。 現(xiàn)代基因工程的創(chuàng)始人 P 1973年，美國斯坦福大學(xué)教授 SGilbert ）分別將編碼胰島素和干擾素的 DNA經(jīng)過體外重新拼接后，導(dǎo)入大腸桿菌中，分別使大腸桿菌合成了胰島素和干擾素。 從 mRNA反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA ? 構(gòu)建基因文庫獲取目的基因存在的問題 —— 費時費事 內(nèi)含子序列 ? 反轉(zhuǎn)錄人工合成互補(bǔ)DNA方法的優(yōu)勢 —— 獲取的 DNA片段往往是 具有特定功能的目的基因 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （ polymerase chain reaction,PCR） 如已知目的基因兩端的序列，則可采用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，在體外合成目的基因。 DNA重組的基本模式 分（離目的基因） 切（割目的基因和載體） 接（連目的基因和載體） 轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞） 篩（選陽性克?。? 表（達(dá)目的基因） “縱向”體系 切 限制性內(nèi)切酶酶切 限制性內(nèi)切酶酶切 酶切 載體和目的基因的切斷 ? 通常采用限制性核酸內(nèi)切酶 (restriction endonuclease)，簡稱限制酶，分別對載體DNA和目的基因進(jìn)行切斷，以便于重組。 ? 時間 ：一般為 57h，載體 overnight以保證酶切完全。當(dāng)載體和目的基因無法采用同一種限制酶進(jìn)行切斷，無法得到相同得粘性末端時，可采用此方法。 ? 酶切是否完全，所以要做載體的自連對照。 二、 感受態(tài)細(xì)胞的制備 ( CaCl2 法 ) ? 將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中 ,冰上放置 10分鐘，然后于 4℃ 下3000g離心 10分鐘。 ? 試劑的質(zhì)量 : 所用的試劑 ,如 CaCl2 等均需是最高純度的( AR.),并用超純水配制 ,最好分裝保存于干燥的冷暗處。 轉(zhuǎn)化的操作步驟 為了提高轉(zhuǎn)化效率 , 實驗中要考慮以下幾個重要因素： ? 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒 DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài) DNA(cccDNA)。 轉(zhuǎn)化方法 真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 受體細(xì)胞系統(tǒng) 永生細(xì)胞系 細(xì)胞特異性的選擇標(biāo)記 對抗某種藥物 ? 電穿孔法：原理與原核生物的電穿孔法一樣。 ? 脂質(zhì)體（ liposome）介導(dǎo)法： 將 DNA包裹在人工制備的磷脂雙分子層的膜狀結(jié)構(gòu)內(nèi)，通過脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的融合而將 DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。 ? 受體菌是 Z基因突變型，只含編碼 β－半乳糖苷酶Ｃ端 aa的序列。將單一細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增后分別提取其 DNA，用重組時所用的同一限制酶進(jìn)行酶切，再將其與不含目的基因的載體一起進(jìn)行電泳比較分析，如發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)目的基因片段的電泳帶即證明重組體中帶有目的基因。在 A存在下，核苷酸的從頭合成途徑被阻斷，不能合成 AMP、 TMP及 GMP。一般長 4060bp，富含 AT堿基對 具有保守序列： 10區(qū)（ pribnow box）： TATAAT 35區(qū)： 終止子（ terminator， T） :位于基因 3’端 ,給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號的 DNA序列 ? 與翻譯有關(guān)的原核細(xì)胞結(jié)構(gòu)： ——核糖體結(jié)合位點 翻譯起始密碼子 AUG 或 GUG SD順序（ shinedalgarno）： AUG上游 311 bp 長約 39bp mRNA與 16s核糖體亞基間的識別與結(jié)合序列 人類對大腸桿菌經(jīng)過長期的研究，對其特性和遺傳背景了解得最清楚，大腸桿菌培養(yǎng)操作簡單、生長繁殖快、價格低廉，人們用大腸桿菌用外源基因的表達(dá)工具已有幾十年的經(jīng)驗積累，大腸桿菌表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其它基因表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的目的蛋白量甚至能超過細(xì)菌總蛋白量的 80%。 Promoters for E. coli ? 終止子： 強(qiáng)終止子、二聚體終止子 終止子 啟動子 轉(zhuǎn)錄過度 影響目的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率 干擾基因載體的復(fù)制等生物學(xué)功能 增加受體細(xì)胞的無效能量消耗 ? SD序列：影響翻譯效率 SD序列與 16SrRNA的互補(bǔ)性 SD的后續(xù)序列的核苷酸組成 SD與起始密碼之間的距離 mRNA SD ? 融合型表達(dá)載體： 融合蛋白 ? 非融合型表達(dá)載體： 天然完整蛋白 ? 分泌型表達(dá)載體： 產(chǎn)物可跨膜分泌至胞周間隙 原核表達(dá)載體的類型 融合型表達(dá)載體 P SD Foreign DNA 融合型表達(dá)載體 融合基因 優(yōu)點： ? 表達(dá)效率高 ? 產(chǎn)物穩(wěn)定 ? 易鑒定：融合蛋白分子量大，電泳可鑒定 ? 易純化：利用融合原核多肽的特性 技術(shù)關(guān)鍵： 克隆基因插入原核序列 3’端而維持正確閱讀框架。 ? ②在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)重組基因所需要的元件，包括 啟動子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止和
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