【正文】 it 除去， 大的片段要用切膠回收去除。 Tvector Tvector兩條鏈的 5’端含有一個(gè)游離的 T PCR過程中，普通的 Taq酶可在產(chǎn)物的 3’端多加一個(gè) A DNA重組的基本模式 分（離目的基因） 切（割目的基因和載體） 接（連目的基因和載體） 轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞） 篩（選陽性克?。? 表（達(dá)目的基因） “縱向”體系 接 載體和目的基因的連接 （一）粘性末端連接法： ? 當(dāng)載體 DNA和目的基因均用同一種限制酶進(jìn)行切斷時(shí)，二者即可帶有相同的粘性末端。如將載體與目的基因混合在一起，二者即可通過粘性末端進(jìn)行互補(bǔ)粘合，再加入 DNA連接酶，即可封閉其缺口，得到重組體。 ? 較少的情況下，對(duì)產(chǎn)生的平端也可直接進(jìn)行連接。 即將帶有切口的載體與所獲得的目的基因連接起來，得到重新組合后的 DNA分子。 載體 DNA與目的基因的連接 （二）人工接尾法： ? 即同聚物加尾連接法。當(dāng)載體和目的基因無法采用同一種限制酶進(jìn)行切斷，無法得到相同得粘性末端時(shí)，可采用此方法。 ? 此法首先使用單鏈核酸酶將粘性末端切平，再在末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下，將脫氧核糖核苷酸添加于載體或目的基因的 339。端，如載體上添加一段 polyG，則可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通過堿基互補(bǔ)進(jìn)行粘合，再由 DNA連接酶連接。 末端轉(zhuǎn)移酶（ terminal transferase） 該酶全稱為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（ terminal deoxynucleotidyl transferase），它所催化的反應(yīng)與DNA pol I 相似，所不同的是它不需要模板，它可以含有３’－ＯＨ的ＤＮＡ片段為引物，在３’－ＯＨ端加入核苷酸達(dá)幾百個(gè)。末端轉(zhuǎn)移酶常用于在平頭ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，從而形成粘性末端。 （三）人工接頭連接法： ? 將人工連接器（ linker，即一段人工合成的含有多種限制酶切點(diǎn)的小分子 DNA片段，約 10~20個(gè)核苷酸）連接到平末端 DNA分子 (載體和目的基因 )上，即有可能使用同一種限制酶對(duì)載體和目的基因進(jìn)行切斷，得到可以互補(bǔ)的粘性末端。 ? 這種方法的優(yōu)點(diǎn)是克隆位點(diǎn)具有限制酶的酶切位點(diǎn)。 連接體系的建立： ? 溫度：粘末端連接： 1218℃ (1620 hours) 平末端連接：室溫（低于 30℃ ) ? DNA量：載體分子數(shù) /目的基因分子數(shù) =1： 35 ? 酶量：平端連接時(shí)需加大酶量 連接反應(yīng)體系越小越好，相對(duì)而言，酶切體系稍大較好 連接失敗后 ? 一步一步向上游檢測(cè)問題所在，所以分子 克隆部分 “留一半 ”的原則有時(shí)候是很有用的。 ? 酶切是否完全，所以要做載體的自連對(duì)照。 ? 載體酶切回收是否考慮到切除片段的大小， ? 是否要用切膠回收更保險(xiǎn)。 DNA重組的基本模式 分（離目的基因） 切（割目的基因和載體） 接（連目的基因和載體） 轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞） 篩（選陽性克?。? 表（達(dá)目的基因） “縱向”體系 轉(zhuǎn) 重組體的轉(zhuǎn)化 受體細(xì)胞 重組體的轉(zhuǎn)化 宿主菌或受體細(xì)胞 ? 原核系統(tǒng) 大腸桿菌 枯草桿菌 ? 真核系統(tǒng) 酵母菌酵母 昆蟲細(xì)胞 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（細(xì)菌轉(zhuǎn)化） 受體細(xì)胞的選擇： ? 限制缺陷型 : 避免修飾和降解 ? 重組缺陷型： 避免重組整合 ? 轉(zhuǎn)化親和型： 較高的可轉(zhuǎn)化性 ? 遺傳互補(bǔ)型： 利于篩選 ? 感染缺陷型： 防止感染 感受態(tài)細(xì)胞 （ petent cell） ? 所謂感受態(tài)， 就是細(xì)菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理狀態(tài)。 ? 如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源 DNA。 ? 受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如電擊法，CaCl2等化學(xué)試劑法）的處理后 ,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變，成為能允許外源 DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞（ Competent cells）。 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 ( 化學(xué)方法 ) 大腸桿菌細(xì)胞 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 CaCl2處理 目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法是 CaCl2法 , CaCl2 法簡(jiǎn)便易行 ,且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實(shí)驗(yàn)的要求 ,制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí) ,可加入占總體積 15％的無菌甘油于 70℃ 保存(半年 ),因此 CaCl2法為使用更廣泛。 一、 受體菌的培養(yǎng) ? 從 LB平板上挑取新活化的 E. coli DH5α單菌落 ,接種于 35ml LB液體培養(yǎng)基中， 37℃ 下振蕩培養(yǎng) 12小時(shí)左右 ,直至對(duì)數(shù)生長后期。將該菌懸液以 1:1001:50的比例接種于 100ml LB液體培養(yǎng)基中， 37℃ 振蕩培養(yǎng) 23小時(shí)至 OD600 ＝ 。 二、 感受態(tài)細(xì)胞的制備 ( CaCl2 法 ) ? 將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中 ,冰上放置 10分鐘，然后于 4℃ 下3000g離心 10分鐘。 ? 棄去上清 ,用預(yù)冷的 mol/L的 CaCl2 溶液 10ml輕輕懸浮細(xì)胞 ,冰上放置 1530分鐘后， 4℃ 下 3000 g離心 10分鐘。 ? 棄去上清 ,加入 4ml預(yù)冷含 15%甘油的 mol/L的 CaCl2 溶液 ,輕輕懸浮細(xì)胞 ,冰上放置幾分鐘 ,即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。 ? 感受態(tài)細(xì)胞分裝成 200μl的小份 ,貯存于 70℃ 可保存半年。 感受態(tài)細(xì)胞的制備的操作步驟 為了提高轉(zhuǎn)化效率 , 實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個(gè)重要因素： ? 細(xì)胞生長狀態(tài)和密度 : 不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于４ ℃ 的培養(yǎng)菌，最好從－ 70℃ 或 20℃ 甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期時(shí)為好，可通過監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的 OD600 來控制。DH5α菌株的 OD600 為 ,細(xì)胞密度在 5 107 個(gè) /ml左右 (不同的菌株情況有所不同 ),這時(shí)比較合適。密度過高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。 ? 試劑的質(zhì)量 : 所用的試劑 ,如 CaCl2 等均需是最高純度的( AR.),并用超純水配制 ,最好分裝保存于干燥的冷暗處。 ? 防止雜菌和雜 DNA的污染：整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行 , 所用器皿 , 如離心管 , tip頭等經(jīng)高壓滅菌處理 ,所有的試劑都要滅菌 ,且注意防止被其它試劑、 DNA酶或雜 DNA所污染 , 否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜 DNA的轉(zhuǎn)入 , 為