基因重組與基因工程技術(shù)課件-預(yù)覽頁(yè)
【正文】 限制缺陷型 : 避免修飾和降解 ? 重組缺陷型： 避免重組整合 ? 轉(zhuǎn)化親和型： 較高的可轉(zhuǎn)化性 ? 遺傳互補(bǔ)型： 利于篩選 ? 感染缺陷型： 防止感染 感受態(tài)細(xì)胞 （ petent cell） ? 所謂感受態(tài)， 就是細(xì)菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理狀態(tài)。 一、 受體菌的培養(yǎng) ? 從 LB平板上挑取新活化的 E. coli DH5α單菌落 ,接種于 35ml LB液體培養(yǎng)基中， 37℃ 下振蕩培養(yǎng) 12小時(shí)左右 ,直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。 ? 棄去上清 ,加入 4ml預(yù)冷含 15%甘油的 mol/L的 CaCl2 溶液 ,輕輕懸浮細(xì)胞 ,冰上放置幾分鐘 ,即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。DH5α菌株的 OD600 為 ,細(xì)胞密度在 5 107 個(gè) /ml左右 (不同的菌株情況有所不同 ),這時(shí)比較合適。 大腸桿菌細(xì)胞 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 得到噬菌斑或單菌落 與重組 DNA共同冰浴 而后 42℃ 短暫熱刺激 CaCl2處理 受體細(xì)菌 50100mmol/L CaCl2 感受態(tài)細(xì)菌 重組體轉(zhuǎn)入細(xì)菌 轉(zhuǎn) 化 ? 從 70℃ 冰箱中取 200μl感受態(tài)細(xì)胞懸液 ,室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上。 ? 將上述菌液搖勻后取 100μl 涂布于含 Amp的篩選平板上，正面向上放置半小時(shí)，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿 ,37℃ 培養(yǎng) 1624小時(shí)。 1 ng的 cccDNA即可使 50μl 的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。電穿孔法的轉(zhuǎn)化效率比鈣轉(zhuǎn)化法高 2~3個(gè)數(shù)量級(jí)。將 DNA溶液加入到 CaCl2中，然后在強(qiáng)烈震蕩下加入由 Na2HPO4和NaH2PO4組成的磷酸緩沖液，使溶液產(chǎn)生磷酸鈣沉淀并將DNA包裹在沉淀中。 ? 激光微束穿孔法： 利用直徑很小、能量很高的激光束在細(xì)胞表面引起可逆性的穿孔，使 DNA進(jìn)入細(xì)胞。 DNA重組的基本模式 分（離目的基因） 切（割目的基因和載體） 接（連目的基因和載體） 轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞） 篩（選陽(yáng)性克?。? 表（達(dá)目的基因） “縱向”體系 重組體克隆的篩選與鑒定 轉(zhuǎn)化后的克隆群體： 陽(yáng)性重組子的 篩選與 鑒定 ? 遺傳檢測(cè)法 (根據(jù)重組載體的標(biāo)志作篩選 ) 插入失活法 α互補(bǔ)法 ? 限制性酶切法 ? PCR法 ? 雜交篩選法 ? 免疫學(xué)方 法 ? 核苷酸序列測(cè)定法 遺傳檢測(cè)法 菌株為某種抗生缺陷型， 而質(zhì)粒上帶有該抗性基因（如氨芐青霉素， 卡拉霉素等）這樣只有轉(zhuǎn)化子才能在含該抗生素的培養(yǎng)基上長(zhǎng)出。 如果外源 DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活 如果外源 DNA插入，四環(huán)素抗性基因失活 pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu) pBR322 Amp Tet 插入片段 Amp平板 Tet平板 α互補(bǔ)法 —— 藍(lán)白篩選 ? 現(xiàn)在使用的許多載體（如ＰＵＣ系列）有含有一個(gè)大腸桿菌ＤＮＡ的短區(qū)段，其中含有 β－半乳糖苷酶基因（ lacZ）的調(diào)控序列和 N端１４６個(gè)氨基酸偏碼區(qū)（全長(zhǎng) 1201氨基酸） 。 ? 具有 α互補(bǔ)的細(xì)菌培養(yǎng)在含 IPTG及 Xgal（ 5溴 4氯 3吲哚 βD半乳糖苷）的培養(yǎng)基上。 ? IPTG起誘導(dǎo)表達(dá)的作用，相當(dāng)于乳糖，但它的誘導(dǎo)效率遠(yuǎn)高于乳糖。 雜交篩選法 為了進(jìn)一步鑒定重組基因體中的目的基因，可采用與目的基因部分互補(bǔ)的 DNA片段作為探針，與含有重組體的細(xì)菌菌落進(jìn)行雜交，經(jīng)放射自顯影，如結(jié)果為陽(yáng)性，即可確定重組體中帶目的基因。新霉素抗性基因（ neo）能在真核細(xì)胞中表達(dá)并能使 G418失活（ neo基因編碼一個(gè)磷酸轉(zhuǎn)移酶），細(xì)胞可以生長(zhǎng)。 氨基喋呤篩選法 氨基喋呤 (HAT選擇 ) 核酸從頭合成 （ ） 核酸補(bǔ)救合成（ TK酶） TK TK+ DNA重組的基本模式 分（離目的基因） 切（割目的基因和載體） 接（連目的基因和載體） 轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞） 篩（選陽(yáng)性克?。? 表（達(dá)目的基因） “縱向”體系 外源基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá) 重組子 目的基因的 mRNA 表達(dá)蛋白質(zhì) 大腸桿菌（ ） 受體細(xì)胞 外源基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá) 原核生物基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)特點(diǎn) ? 原核生物染色體 DNA是裸露的環(huán)形 DNA，其轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)的連續(xù)進(jìn)行。操縱子是一組功能上相關(guān)，受同一調(diào)控區(qū)控制的基因組成的一個(gè)遺傳單位。 設(shè)計(jì)外源基因在大腸桿菌表達(dá)就需要外源基因在大腸桿菌中表達(dá)所需要的元件， 包括轉(zhuǎn)錄起始必需的啟動(dòng)子、翻譯起始所必需的核糖體識(shí)別序列 等；外源基因表達(dá)的產(chǎn)物可能會(huì)對(duì)大腸桿菌有毒害作用，會(huì)影響細(xì)菌的生存繁殖，所以大多數(shù)表達(dá)載體都帶有 誘導(dǎo)性表達(dá)所需要的元件 ，即有 操縱子序列以及與之配套的調(diào)控基因 等；外源基因還應(yīng)當(dāng)插入到適合于表達(dá)的位置，所以表達(dá)載體中要設(shè)有適合的 多克隆位點(diǎn) ；此外還應(yīng) 具備基因克隆篩選的條件 ，包括在細(xì)胞中復(fù)制必需的 復(fù)制起始序列、篩選標(biāo)志 如抗藥性基因等。 ? PL和 PR啟動(dòng)子：噬菌體早期左 /右向啟動(dòng)子，受 λ噬菌體 CI基因負(fù)調(diào)控。 分泌型表達(dá)載體 pINIIIompA1 ? 沒有真核轉(zhuǎn)錄后加工的功能，不能進(jìn)行 mRNA的剪接，所以只能表達(dá) cDNA而不能表達(dá)真核的基因組基因； ? 沒有真核翻譯后加工的功能，表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，不能進(jìn)行糖基化、磷酸化等修飾，難以形成正確的二硫鍵配對(duì)和空間構(gòu)像折疊，因而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)常沒有足夠的生物學(xué)活性； ? 表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)常是不溶的，會(huì)在細(xì)菌內(nèi)聚集成包涵體（ inclusion body），尤其當(dāng)表達(dá)目的蛋白量超過細(xì)菌體總蛋白量 10%時(shí)，就很容易形成包涵體。 原核表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn) ? 具轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng) ? 具翻譯后修飾系統(tǒng) ? 可實(shí)現(xiàn)真正的分泌表達(dá) ? 基因治療 真核表達(dá)系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢(shì) 真核基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)調(diào)控特點(diǎn) 真核基因組的復(fù)雜性： ? 真核基因組龐大，具大量非編碼序列 mRNA豐度不同 ? 結(jié)構(gòu)復(fù)雜：染色質(zhì)、核膜、線粒體 表達(dá)調(diào)控多樣 ? 不連續(xù)性：內(nèi)含子、外顯子 ? 沒有操縱子結(jié)構(gòu) 據(jù)受體細(xì)胞及表達(dá)載體的不同分為 3種： ? 酵母表達(dá)系統(tǒng) ? 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) ? 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 要表達(dá)真核生物的蛋白質(zhì)，采用真核表達(dá)系統(tǒng)自然應(yīng)比原核系
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