【正文】 SD： ATG：第一個(gè)密碼子 非融合型表達(dá)載體 pPLLamda PL啟動(dòng)子 溫度誘導(dǎo) 插入位點(diǎn) HpaI 分泌型表達(dá)載體： ? 主要元件： 啟動(dòng)子和 SD序列 信號(hào)肽序列 ： SD下游，編碼信號(hào)肽，可引導(dǎo)蛋白跨膜 ? 優(yōu)點(diǎn)：分泌表達(dá)，避免降解。 真核表達(dá)載體 真核表達(dá)元件： ? 啟動(dòng)子 /增強(qiáng)子 ? 克隆位點(diǎn) ? 終止信號(hào)和加poly(A)信號(hào) ? 剪接識(shí)別信號(hào) ? 復(fù)制與選擇元件 外源基因的表達(dá)： ? 胞內(nèi)表達(dá) ? 分泌表達(dá)：在 MCS前加入信號(hào)肽序列 缺點(diǎn) : ? 不能實(shí)現(xiàn)全部的翻譯后修飾功能 Example IPTG T7 RNA pol His6 cDNA Calreticulin as an example (Calreticulin is an ER chaperone) 鈣網(wǎng)蛋白 calreticulin 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的一種需 Ca2+的凝集素樣分子伴侶蛋白 (inhibits T7 pol) Inducibility in E. coli: via T7 RNA polymerase an inducible OFF ON + IPTG Lac repressor Lysozyme To squelch background low level of T7 pol calreticulin Lac repressor Lac repressor gene (petes with his) Purification of the cloned gene product (Nitriloacetic acid chelate, NTA) MBP = maltose binding protein GST = glutathioneStransferase Assorted protein tags used for purification (binds to biotin site) (Gets biotinylated in vivo) (Ampresistance) (IgGbinding domain from Protein A) Enterokinase: Asp Asp Asp Asp Lys …… OR Tag removal after purification OR TEV protease (tobacco etch virus): GluXXTyrXGlnSer 目的蛋白的分離純化 親和柱 分子篩 離子交換 疏水層析 抗原抗體 目的蛋白 基因載體 目的基因 質(zhì)粒 噬菌體 病毒 PCR cDNA 人工合成 基因文庫(kù) 限制性內(nèi)切酶 有切口的載體 有切口的目的基因 DNA連接酶 重組體 轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)染 體外包裝 帶重組體的宿主細(xì)胞 表型篩選 電泳法 核酸雜交 免疫學(xué)方法 目的基因的表達(dá) 演講完畢，謝謝觀看！ 。生成包涵體的原因可能有是蛋白質(zhì)合成速度太快，多肽鏈相互纏繞，缺乏使多肽鏈正確折疊的因素，導(dǎo)致疏水基因外露等。 外源基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的必要條件： ? 刪除內(nèi)含子和 5’非編碼區(qū) ? 外源基因置于強(qiáng)啟動(dòng)子和 SD順序控制下 ? 維持正確開(kāi)放閱讀框架（ ORF） ? mRNA穩(wěn)定且可有效轉(zhuǎn)譯，形成的蛋白質(zhì)不被降解 原核表達(dá)載體 (expressing vector) ? 特點(diǎn)：帶表達(dá)構(gòu)件 —轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的 DNA序列 ? 大腸桿菌表達(dá)載體：含啟動(dòng)子 —核糖體結(jié)合位點(diǎn) —克隆位點(diǎn) —轉(zhuǎn)錄終止信號(hào) ? 啟動(dòng)子： trplac(tac)啟動(dòng)子、 λ噬菌體 PL啟動(dòng)子、T7噬菌體啟動(dòng)子 ? 核糖體結(jié)合位點(diǎn) (ribosomebinding site,RBS)：起始密碼子 (ATG)和 SD序列 ? 轉(zhuǎn)錄終止序列 影響外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)效率的因素： 啟動(dòng)子 終止子 SD mRNA 多肽鏈 啟動(dòng)子的選擇和改造 強(qiáng)啟動(dòng)子 可調(diào)控啟動(dòng)子 P ? 啟動(dòng)子：建立表達(dá)載體時(shí)，選擇強(qiáng)啟動(dòng)子。 ? 原核生物形成多順?lè)醋?mRNA： mRNA在合成過(guò)程中和多個(gè)核糖體結(jié)合，翻譯形成多條肽鏈。 ? 32P標(biāo)記的 DNA分子探針 ? 雜交 ? 放射自顯影法 ? 依據(jù)：堿基互補(bǔ)配對(duì)原則 ? 步驟： ①合成核酸探針（與所需基因互補(bǔ)的核苷酸短鏈，并用同位素標(biāo)記） ②升高溫度或改變 pH使 DNA變性 ③分子雜交（常用原位分子雜交）如果基因文庫(kù)中的一個(gè) DNA片段能和探針結(jié)合形成雙鏈，這一片段即含有所需基因。 Xgal本身是無(wú)色的，在半乳糖苷酶的水解下產(chǎn)生蘭色的物質(zhì)（被水解為無(wú)色的半乳糖及深蘭色的 5溴 4氯靛蘭），因此會(huì)形成藍(lán)色菌落。 對(duì)于帶有抗藥基因的質(zhì)粒重組體，可采用 插入滅活法 進(jìn)行篩選。將這些沉淀加入到細(xì)胞中，利用細(xì)胞的胞飲作用將 DNA導(dǎo)入到細(xì)胞中。當(dāng)所轉(zhuǎn)化的ＤＮＡ很難得時(shí)（如用從相對(duì)難得的樣品中提取 mRNA而合成的 cDNA),這就顯得格外重要。 ? 加入 pBS質(zhì)粒 DNA溶液 (含量不超過(guò) 50 ng,體積不超過(guò) 10μl)，輕輕搖勻，冰上放置 30分鐘后。 ? 感受態(tài)細(xì)胞分裝成 200μl的小份 ,貯存于 70℃ 可保存半年。 ? 如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源 DNA。 末端轉(zhuǎn)移酶（ terminal transferase） 該酶全稱為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（ terminal deoxynucleotidyl transferase），它所催化的反應(yīng)與DNA pol I 相似，所不同的是它不需要模板，它可以含有３’－ＯＨ的ＤＮＡ片段為引物，在３’－ＯＨ端加入核苷酸達(dá)幾百個(gè)。 Tvector Tvector兩條鏈的 5’端含有一個(gè)游離的 T PCR過(guò)程中，普通的 Taq酶可在產(chǎn)物的 3’端多加一個(gè) A DNA重組的基本模式 分（離目的基因） 切（割目的基因和載體） 接（連目的基因和載體） 轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞） 篩（選陽(yáng)性克?。? 表（達(dá)目的基因） “縱向”體系 接 載體和目的基因的連接 （一）粘性末端連接法： ? 當(dāng)載體 DNA和目的基因均用同一種限制酶進(jìn)行切斷時(shí)，二者即可帶有相同的粘性末端。突出粘