【正文】 載體的一般結(jié)構(gòu) ? 存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀DNA分子。 從 mRNA反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA ? 構(gòu)建基因文庫(kù)獲取目的基因存在的問(wèn)題 —— 費(fèi)時(shí)費(fèi)事 內(nèi)含子序列 ? 反轉(zhuǎn)錄人工合成互補(bǔ)DNA方法的優(yōu)勢(shì) —— 獲取的 DNA片段往往是 具有特定功能的目的基因 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （ polymerase chain reaction,PCR） 如已知目的基因兩端的序列，則可采用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，在體外合成目的基因。 ? 化學(xué)合成的不足之處在于： 要已知基因的核苷酸順序； 基因不能太大，這一方面是測(cè)定核苷酸（或氨基酸）順序比較困難，另一方面是因?yàn)槊看蝺H能合成幾百ｂｐ的短片段，短片段越多，要連接成正確的基因順序就越困難，得率越低； 價(jià)格昂貴。Gilbert ）分別將編碼胰島素和干擾素的 DNA經(jīng)過(guò)體外重新拼接后，導(dǎo)入大腸桿菌中，分別使大腸桿菌合成了胰島素和干擾素。這表明“雜合質(zhì)?！痹诖竽c桿菌的細(xì)胞分裂時(shí)也能自我復(fù)制。 1973年，美國(guó)斯坦福大學(xué)教授 S 基因重組技術(shù)作為分子生物學(xué)最重要、最基本的技術(shù)之一，是許多分子生物 ,生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)施的基礎(chǔ)。 現(xiàn)代基因工程的創(chuàng)始人 P 科恩 和加州大學(xué)舊金山分校教授 H 科恩隨后以 DNA重組技術(shù)發(fā)明人的身份向美國(guó)專利局申報(bào)了世界上第一個(gè)基因工程的技術(shù)專利。 DNA重組的基本模式 分（離目的基因） 切（割目的基因和載體） 接（連目的基因和載體） 轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞） 篩（選陽(yáng)性克?。? 表（達(dá)目的基因） “縱向”體系 目的基因 基因載體 重組體 分 切 接 轉(zhuǎn) 篩 表 總體技術(shù)路線 (分 )目的基因及載體的分離 需要克隆的 DNA片段： 化學(xué)合成法 cDNA文庫(kù) 基因組 DNA文庫(kù) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 目的基因的獲取 ? 從基因所在生物直接取得 用限制酶剪切供體 DNA 用機(jī)械的方法 eg 超聲波 化學(xué)合成法 人工合成： ? 根據(jù)已知多肽鏈的氨基酸順序，利用遺傳密碼表推定其核苷酸順序再進(jìn)行人工合成。 ? 用途： PCR引物 ,測(cè)序引物 ,定點(diǎn)突變 ,核酸雜交探針 從基因文庫(kù)中篩選 ? 將某一種基因 DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嗪螅c載體 DNA重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到含全部基因組 DNA的種群，稱為 G文庫(kù) (genomic DNA library)。但此法可能會(huì)造成克隆的目的基因堿基序列的改變。 ? 具有 自我復(fù)制 功能。 ? 限制酶目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn) 400多種，所識(shí)別的順序往往為 48個(gè)堿基對(duì)，且有回文結(jié)構(gòu)。形成粘性末端 (cohesive end)者較有利于載體 DNA和目的基因的重組。 不能時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，以防止內(nèi)切酶的 star活性，降低特異性。 ? 較少的情況下，對(duì)產(chǎn)生的平端也可直接進(jìn)行連接。 ? 此法首先使用單鏈核酸酶將粘性末端切平，再在末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下，將脫氧核糖核苷酸添加于載體或目的基因的 339。 （三）人工接頭連接法： ? 將人工連接器（ linker，即一段人工合成的含有多種限制酶切點(diǎn)的小分子 DNA片段，約 10~20個(gè)核苷酸）連接到平末端 DNA分子 (載體和目的基因 )上，即有可能使用同一種限制酶對(duì)載體和目的基因進(jìn)行切斷，得到可以互補(bǔ)的粘性末端。 ? 載體酶切回收是否考慮到切除片段的大小， ? 是否要用切膠回收更保險(xiǎn)。 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 ( 化學(xué)方法 ) 大腸桿菌細(xì)胞 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 CaCl2處理 目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法是 CaCl2法 , CaCl2 法簡(jiǎn)便易行 ,且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實(shí)驗(yàn)的要求 ,制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí) ,可加入占總體積 15％的無(wú)菌甘油于 70℃ 保存(半年 ),因此 CaCl2法為使用更廣泛。 ? 棄去上清 ,用預(yù)冷的 mol/L的 CaCl2 溶液 10ml輕輕懸浮細(xì)胞 ,冰上放置 1530分鐘后， 4℃ 下 3000 g離心 10分鐘。細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為好，可通過(guò)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的 OD600 來(lái)控制。 ? 防止雜菌和雜 DNA的污染：整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行 , 所用器皿 , 如離心管 , tip頭等經(jīng)高壓滅菌處理 ,所有的試劑都要滅菌 ,且注意防止被其它試劑、 DNA酶或雜 DNA所污染 , 否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜 DNA的轉(zhuǎn)入 , 為以后的篩選、鑒定帶來(lái)不必要的麻煩。 ? 向管中加入 1ml LB液體培養(yǎng)基 (不含 Amp)，混勻后 37℃ 振蕩培養(yǎng) 1小時(shí)，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài) ,并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因 (Ampr )。 ? 轉(zhuǎn)化效率與外源 DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源 DNA的量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí) ,轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。 對(duì)照實(shí)驗(yàn) ? ：在高壓電場(chǎng)下使細(xì)胞產(chǎn)生瞬間的穿孔，這個(gè)穿孔足夠大并可維持足夠的時(shí)間，使外源 DNA進(jìn)入受體細(xì)胞。 ? 磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)：主要用于動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。 磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染 重組體 + 磷酸鈣微粒 內(nèi)吞作用 重組體進(jìn)入細(xì)胞 大顆粒 轉(zhuǎn)染方法 ? 基因槍轉(zhuǎn)染法： 利用被電場(chǎng)或機(jī)械加速的金屬微粒能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的基本原理，先將 DNA溶液與鎢、金等金屬微粒一起保溫，使 DNA吸附在金屬微粒表面，隨高速的金屬微粒直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 ? 多聚物介導(dǎo)法： 利用多聚物如 PEG、二乙胺乙基葡聚糖（ DEAE葡聚糖）、多聚賴氨酸、多聚鳥(niǎo)氨酸等與二價(jià)陽(yáng)離子、 DNA混合形成沉淀顆粒，通過(guò)細(xì)胞的胞飲作用而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能夠生長(zhǎng)，而在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)的細(xì)菌即為帶重組體的細(xì)菌。當(dāng)外源基因插入時(shí)，在 IPTG （異丙基硫代 βD半乳糖苷）誘導(dǎo)下合成 β－半乳糖苷酶 N端片斷，和受體菌的 C端片斷溶為一體后，可產(chǎn)生蛋白質(zhì)間的互補(bǔ)，形成有活性的 β－半乳糖苷酶，稱 α互補(bǔ)。通過(guò)顏色不同而區(qū)分重組子和非重組子。 凝膠電泳檢測(cè) 加樣孔 DNA Marker 空質(zhì)粒 重組質(zhì)粒 重組質(zhì)粒酶切 重組質(zhì)粒的 PCR擴(kuò)增片段 PCR法 利用的目標(biāo)引物 (例如分離目的基因所使用的引物 )，抽提需要篩選的克隆的重組 DNA作為模板 , 進(jìn)行 PCR擴(kuò)增 ,根據(jù)是否擴(kuò)增出目的片段來(lái)確定陽(yáng)性克隆。 ACTGAAGGCT 真核細(xì)胞的篩選 ?