高中生物基因重組與基因工程大學(xué)-wenkub
2023-01-23 13:36:06 本頁面
【正文】 P] dTTP E. coli DNA POL I ㈡ Klenow片段（ DNA ） Klenow片段用途 ⑴ 補(bǔ)齊雙鏈 DNA的 3ˊ 末端； ⑵ 用標(biāo)記堿基補(bǔ) 齊 3ˊ 末端 ； 聚合酶Klen ow DN A [ 32P]d NT Pα雙鏈 DNA粘端539。 539。 539。 539。 339。 二、 DNA聚合酶 （ 最常用的 DNA聚合酶有以下 4種 ） DNA聚合酶 Ⅰ （全酶） DNA聚合酶 Ⅰ 大片段 —— Klenow片段 Taq DNA聚合酶 T4 噬菌體 DNA聚合酶 ㈠ DNA聚合酶 Ⅰ DNA聚合酶 Ⅰ （ DNA pol Ⅰ ） 是一個(gè)具有 3 種酶活性的多功能性酶。 可變酶 可變酶 識別順序中的一個(gè)或幾個(gè)堿基是可變的， 并且識別順序往往超過 6個(gè)堿基對。 TT 3 39。 3 39。 3 39。339。339。339。C C A T GG T A C C 3 39。 A AAAAA339。 A AAAAA339。指來源不同，但具有 相同的識別 序列 。 C C C3 39。 C C C3 39。339。339。 粘性末端 (sticky end) 是指經(jīng)內(nèi)切酶特異切割后產(chǎn)生的 5ˊ －末端突出和3ˊ －末端突出的堿基序列相互間具有互補(bǔ)性 。 本章主要內(nèi)容 重要的工具酶 基因克隆常用的載體 重組 DNA基本原理 重組技術(shù)在醫(yī)學(xué)和制藥 工業(yè)中的應(yīng)用 第一節(jié) 重要的工具酶 工 具酶 基因工程中的工具酶主要包括 用于 DNA和RNA分子 的 切割 、 連接 、 聚合 、 逆 轉(zhuǎn)錄 等 相關(guān)的各種酶類 。第十七章 基因重組與基因工程 (geic rebination and geic engineer) 基因重組 (geic rebination) 是指在體外用酶學(xué)方法將不同來源的 DNA進(jìn)行切割、連接，組成一個(gè)新的 DNA分子的過程，又稱 DNA重組 。 一、限制性核酸內(nèi)切酶 (restriction endonuclease, RE) 是一類由細(xì)菌產(chǎn)生的能專一識別和 切割雙鏈 DNA中的特定堿基序列的核酸內(nèi)切酶，簡稱 限制酶 或 切割酶 。 ⑴ 產(chǎn)生 539。G A C G T C 339。G A C G T C +P s t I339。 G G GG G G 3 39。 G G GG G G 3 39。 在切割 DNA時(shí)，其 切割點(diǎn) 可以是 相同 的，產(chǎn)生平頭末端，稱為 同識同切 ； 切割點(diǎn) 也可以是 不同 的，產(chǎn)生 3ˊ 或 5ˊ 粘性末端，稱為 同識異切 。T T T 5 39。T T T 5 39。G 5 39。539。539。539。 5 39。 5 39。A 5 39。 如， BstpⅠ ，其識別順序?yàn)?GGTNACC。 包括： 5ˊ →3 ˊDNA 聚合酶活性 5ˊ →3 ˊ 核酸外切酶活性 3ˊ →5 ˊ 核酸外切酶活性 DNA pol Ⅰ 應(yīng)用 ⑴ 常用來 催化 DNA缺口平移反應(yīng)，制備高比活性 DNA 探針 ； ⑵ cDNA第二條鏈的合成； ⑶ 對 DNA3?突出末端進(jìn)行標(biāo)記； ⑷ DNA序列分析。 539。 339。 339。 339。外切酶Ⅲ變性+539。339。339。539。標(biāo)記探針標(biāo)記末端⑶ 用于 cDNA克隆中第二股鏈的合成 ； ⑷ DNA序列分析。 四、 DNA連接酶 (DNA ligase) 催化雙鏈 DNA中一條鏈的 3ˊ － OH與另一條鏈的5ˊ － PO3H2形成磷酸二酯鍵 ， 從而構(gòu)成完整的 DNA長鏈 。端前，去除 539。 應(yīng)用 ① 探針標(biāo)記 G32G32G32G32 G32G32G32G32 ② 在載體和待克隆的片段上形成同聚物尾 ， 以便于進(jìn)行連接 3180。端合成同聚尾 第二節(jié) 基因克隆常用的載體 載體 (vector) 是指能在連接酶作用下和外源 DNA片段連接起來，并運(yùn)送到宿主細(xì)胞的運(yùn)載工具。 有質(zhì)粒 DNA、噬菌體 DNA和病毒 DNA三類 。 作為克隆載體的質(zhì)粒應(yīng)具備以下特點(diǎn)： 1. 分子量相對較小，能穩(wěn)定存在于細(xì)菌體內(nèi)， 有較高的拷貝數(shù)； 2. 具有 1個(gè)以上的遺傳標(biāo)志，便于篩選； 3. 具有多克隆位點(diǎn)。 λ噬菌體兩種生長途徑（示意圖） λ 噬菌體感染細(xì)菌后的 兩種生長途徑 溶菌性生長 噬菌體感染細(xì)菌后 ， 借助其 2個(gè) COS位點(diǎn)互補(bǔ) 成環(huán) ， 在宿主菌體內(nèi) 連續(xù)復(fù)制 ， 合成大量基因產(chǎn)物 ， 進(jìn)而裝配成噬菌體顆粒 ， 裂解宿主菌 ， 釋放出來的噬菌體又可感染其他細(xì)菌 。 （二）制備 cDNA （ cDNA文庫） 分離目的基因 的 mRNA 逆轉(zhuǎn)錄生成 cDNA單鏈 水解去除 mRNA， 合
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