高中生物基因重組與基因工程大學(xué)-全文預(yù)覽
【正文】 o R IAA T T DNA重組基本過(guò)程 (小結(jié) ) 重組 TTTTAAAAl i g a s eT T A A T T A AA A T T“退火”A A T T轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中( 如 E. c oli )宿主細(xì)胞染色體 DNA重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒體 篩選 篩選含有重組質(zhì)粒的菌株宿主細(xì)胞染色體 DNA重組質(zhì)粒含有外源 DNA 的“工程菌”克隆 含有外源 DNA 的“工程菌”繁殖/ 擴(kuò)增表達(dá) 表達(dá)產(chǎn)物分離純化表達(dá)產(chǎn)物分離純化 五、重組體在宿主細(xì)胞中的表達(dá)和調(diào)控 基因工程的最終目的是通過(guò)載體將外源基因?qū)牒线m的宿主細(xì)胞中高效表達(dá)，產(chǎn)生有重要價(jià)值的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。 1. 插入失活 當(dāng)外源 DNA序列插入質(zhì)粒中某一抗藥基因內(nèi)，使 該基因失活，轉(zhuǎn)化細(xì)胞就不能生長(zhǎng)在含相應(yīng)抗生素的 培養(yǎng)平板上。 感受態(tài)細(xì)胞 用特殊方法處理（ CaCL2）后，受體細(xì)胞才具備接受外源 DNA的能力， 這種細(xì)胞稱(chēng) 感受態(tài)細(xì)胞 。 （三） 人工接頭法 合成 連接子 → 與 DNA平頭末端連接 → 限制酶切割 ,產(chǎn)生粘性末端 → 連接，構(gòu)建重組 DNA。經(jīng) 94℃ 變性、 54℃ 退火及 72℃ 延伸3個(gè)步驟的反復(fù)多次循環(huán)（ 25?30次 ），擴(kuò)增目的基因（見(jiàn) 18章）。 第三節(jié) 重組 DNA基本原理 （ DNA重組基本程序包括下列過(guò)程） 分 — 獲取目的基因和載體 接 — 目的基因與載體的連接 轉(zhuǎn) — 重組 DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞 篩 — 重組 DNA的篩選與鑒定 一、目的基因的獲?。?分 ） 目的基因 是指所要研究或應(yīng)用的基因 ， 也是需要克隆或表達(dá)的基因 。 廣泛應(yīng)用的質(zhì)粒： pBR32質(zhì)粒、 pUC系列等 pBR322質(zhì)粒 ① 4363 bp ② 含一個(gè)復(fù)制點(diǎn) ③ 含一個(gè)抗氨卞青霉素基因(ampR) ④ 一個(gè)抗四環(huán)素基因 (tetR) ⑤ ampR和 tetR抗性基因內(nèi)各有一些限制酶的酶切位點(diǎn)，供外源基因插入 當(dāng)外源基因插入抗藥基因內(nèi)后，抗藥基因失活。 表達(dá)型載體 除需載體必備條件外，還需相應(yīng)的 啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、增強(qiáng)子、終止子 等表達(dá)調(diào)控構(gòu)件。 本節(jié)主要內(nèi)容 載體必須具備的基本條件 載體的分類(lèi) 常用的載體 一、載體必須具備的基本條件 ⒈ 具有獨(dú)立復(fù)制能力 ⒉ 具備多個(gè)限制酶的識(shí)別位點(diǎn) (多克隆位點(diǎn) ) ⒊ 具有 遺傳表型或 篩選 標(biāo)記 ⒋ 有 足夠的容量 以容納外源 DNA片段 ⒌ 可導(dǎo)入受體細(xì)胞。 重要的工具酶 工具酶 活性 限制性核酸內(nèi)切酶 識(shí)別特異堿基序列，切割 DNA T4 DNA連接酶 催化 DNA5ˊ 磷酸與 3ˊ 羥基 形成磷酸二酯鍵 DNA聚合酶 以 DNA為模板合成 DNA 逆轉(zhuǎn)錄酶 以 RNA為模板合成 cDNA 堿性磷酸酶 切除 5?－ 末端磷酸 T4多聚核苷酸激酶 催化核酸 539。端進(jìn)行標(biāo)記 。 用途 ⒈ 制備載體 時(shí)，用堿性磷酸酶處理去除載體分子 5ˊ －端磷酸基后，可防止載體自身環(huán)化連接，提高重組效率。 三、逆轉(zhuǎn)錄酶 (reverse transcriptase) 特點(diǎn) 逆轉(zhuǎn)錄酶是一個(gè)多功能性酶，至少具有以下 3種酶 活性： ⑴ 以單鏈 RNA為模板， 催化合成 cDNA單鏈 ⑵ 具有 RNase H 活性，能水解 RNA:DNA雜交鏈中的 RNA ⑶ 以 DNA為模板， 催化合成 cDNA雙鏈。339。539。339。339。 539。 539。 539。 539。 339。 用于 DNA重組、制備探針、分子雜交、DNA序列分析等。它們作用后 產(chǎn)生相同 的 粘性末端 。 A3 39。 3 39。 3 39。3 39。3 39。3 39。G3 39。 T T T3 39。 T T T3 39。其它特殊性質(zhì) 的 Ⅱ 型限制酶 同裂酶（ 異源同工酶 ） 同尾酶 可變酶 同裂酶 又稱(chēng)異源同工酶。+S m a I5 39。 ⑶ 產(chǎn)生平 (頭末 )端 /鈍端 5 39。 C T G C A G539。粘性末端 C T G C A G539。 限制酶（ Ⅱ 型）識(shí)別及切割位點(diǎn) 特異識(shí)別及切割 4?8個(gè) bp長(zhǎng)度且具有 回文序列 的DNA片斷，主要產(chǎn)生 3種末端結(jié)構(gòu)： 5ˊ －粘性末端 3ˊ －粘性末端 平端或鈍端 回文序列 (palindrome) 是指該部位的核苷酸序列呈 180O反向重復(fù) 。 基因工程 (geic engineering) 是將不同來(lái)源的 DNA片段與載體分子連接形成重組 DNA分子，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，也稱(chēng) 重組 DNA技術(shù) 。 基因克隆 (gene cloning) 將重組 DNA分子導(dǎo)入到合適的受體細(xì)胞中，使其擴(kuò)增和繁殖，以獲得大量的同一 DNA分子，稱(chēng)此為 基因克隆、 DNA克隆或分子克隆 。 根據(jù)限制酶作用特性，一般分為 Ⅰ 、 Ⅱ 和 Ⅲ 型， 其中常用的是 Ⅱ 型限制酶
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