【正文】 細胞或組織作為生物反應(yīng)器，直接生產(chǎn)有用蛋白質(zhì)輕工與食品轉(zhuǎn)基因植物 ：抗病蟲害新品種、抗逆新品種、 生物制藥；基因治療；人工器官農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)傳統(tǒng)的發(fā)酵工程主要用于微生物。在體外，將帶有目的基因的外源 DNA片段連接到能夠自我復制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組 DNA分子。cloning)。目的基因的表達第一節(jié) 基因工程的概念及其主要內(nèi)容一、基因工程的概念：第六章 基因工程原理第一節(jié) 基因操作 (gene將重組 DNA分子轉(zhuǎn)移到適當?shù)氖荏w細胞 (亦稱寄主細胞 )，并與之一起增殖。蛋白質(zhì)組分析酶工程的概念是酶學與工程學的相互滲透和結(jié)合所發(fā)展起來以酶為研究對象，改造并應(yīng)用酶的特異催化功能。現(xiàn)代生物技術(shù)還包括動物、植物細胞和工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)。高品質(zhì)新品種 轉(zhuǎn)基因動物 ：生產(chǎn)有用蛋白質(zhì)和高品質(zhì)的畜產(chǎn)品 /mg美國生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展情況 美國生物制藥產(chǎn)品種類及數(shù)量（ PHRAM）疾病種類 呼吸系統(tǒng)疾病 13消化系統(tǒng)疾病 11血液疾病 7不育癥 3生長發(fā)育不良癥 2妊娠預防 175中藥臨床藥效 的科學評價與分析方法生物技術(shù)的應(yīng)用核酸酶 — 用 于 DNA和 RNA的非特異性切割 forII型 ： 限制與修飾基因產(chǎn)物獨立起作用，在 Ｅ . coli中這兩種基因位于質(zhì)粒上。2.(Ⅱ )（三）、限制酶的特點NI外側(cè)，產(chǎn)生５ ’端突起3’C４）切點大多數(shù)在識別順序之內(nèi)，也有例外EcoRI5’GOHPAATTC3’3’GGGCCC5’5’GGATG(Ｎ )93’5’GGATG(N)93’CCTAC(N)13SacI2.突變分析（ RFLP分析）kD 。GHpaI抑制同種限制酶的活性 ClaI（ ATCGmAT） TaqI（ TCGmA）如： M.一般特點： 3’磷酸酶活性：除去 3’磷酸基后形成 3’OH端，有利于 DNA聚合酶反應(yīng)， pH3.反應(yīng)產(chǎn)物： 5’單磷酸核苷和具缺口或 5’端突起的dsDNA，過度反應(yīng)將導致 DNA降解基因突變 缺失P 539。HO339。 P539。P539。2bHOOH339。A2.切口移位，制備 DNA探針3’5’1.具 3’→5’ 和 5’ →3 ’ 外切酶活性II具 3’→5’ 和 5’ →3 ’ 外切酶活性聚合酶活性， 5’ →3 ’ ,外切酶活性 其切除速度分別為 40和 cpm/μgDNA)。分離自水生棲熱菌，分子量為 94,000，最適反應(yīng)溫度 75℃ ， 和 PCR 5’3’3’3’1.2.PAGCTT3’5’AHOPAGCTT3’TCGAPOHATTCGAA5’AAGCTT3’TTCGAA5’（二）、質(zhì)粒的拷貝數(shù)與不親和性 質(zhì)粒的拷貝數(shù) 是指某種質(zhì)粒在一個細菌細胞內(nèi)的數(shù)目。Bolivar ： 進一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如 M13mp系列載體，含 T3， T7，sp6啟動子載體，表達型載體及各種探針型載體。?注：前三個特點必不可少 。*當充任第一作用時，最好是選擇性標記基因；當完成第二作用時，目前多采用非選擇性的 — 檢測性標記基因。四環(huán)素抗性基因 （ 四環(huán)素抗性基因編碼一種 399Chlorophenicol可結(jié)合在核糖體 50Kanr等 抗性基因均可使這類抗生素 磷酸化 ，使之不能進入細胞內(nèi)。這兩個部分可獨立存在， β— 半乳糖苷酶基因的優(yōu)點 :βLacZ基因的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)物pUC18結(jié)構(gòu) :類型 :終止子翻譯起始區(qū) b.具有較高的拷貝數(shù)，經(jīng)過氯霉素擴增后，每個細胞中可累積 10003000個拷貝，為重組體 DNA的制備提供了極大的方便。重組分子 I 重組分子 Ⅱ (ApsApSpUC18和 pUC19載體利用菌落顏色篩選重組子分子克隆載體的選擇1.DH5αF’ 可供 M13mp系列載體配套使用， M13病毒的感染需要 F’ 的存在3.11,11,下午 20:43:42三月 211比不了得就不比，得不到的就不要。20:43:4220:43:421111,11,下午 20:43:42三月 211楚塞三湘接，荊門九派通。20:43:4220:43:421111,11,20238:43:4220:43:4220:43:4211dolorurnaiaculisfeliseleifendamet,20231一個人即使已登上頂峰，也仍要自強不息。 三月 勝人者有力，自勝者強。 20:43:4220:43:4220:433/11/202320231空山新雨后，天氣晚來秋。 三月 三月 21三月 2120:43:4220:43:42March 20:43:4220:43:4220:433/11/202320231做前，能夠環(huán)視四周；做時，你只能或者最好沿著以腳為起點的射線向前。 三月 三月 21三月 2120:43:4220:43:42March 20:43:4220:43:4220:433/11/2023不表達，選表達載體 (外源基因必須表達，表達產(chǎn)物必須具備活性 ) ⅱ) 免疫法：與上同，但表達產(chǎn)物不一定具生物活性 ⅲ) 雜交法：各種載體均可2) 目的基因的鑒定 次克?。哼x用質(zhì)粒載體，限制酶譜分析，基因結(jié)構(gòu)分析等 定序：定序載體（ M13mp系列），其他質(zhì)粒載體（如 pUC系列，pBR322， T3， T7， SP6啟動子載體）3) 基因表達與調(diào)控 外源基因可表達 — 普通載體 。實驗對象（ 1）供體：遺傳背景與 DNA特點等，其中包括染色體 DNA大小，基因大小與結(jié)構(gòu)，堿基組成，目的基因的產(chǎn)物特點以及遺傳物質(zhì)的傳遞方式等。Tcs）BamHI片段 (Tcr)4)不同類型載體中所缺少的部分必須由外源基因提供。信號肽鏈編碼區(qū) 轉(zhuǎn)化單元 宿主細胞轉(zhuǎn)化d.特點 :上述兩例中的非重組子來源有兩個：特點 :普通型載體LacZβc.為 α鏈編碼的基因稱之為lacZα(編碼 145和 lacZα） Cmr基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，使氯霉素 乙酰化，導致乙酰化的氯霉素不能結(jié)合在核糖體上。 Apr抗性基因編碼一種分泌到細菌細胞周間質(zhì)的酶，可特異地 切割 氨芐青霉素的 β— 內(nèi)酰胺環(huán)，使氨芐青霉素失活。 Tcr） lacZα），絕大多數(shù)為后者。標記基因的作用至少有一個復制起點，因而至少可在一種生物體中自主復制。al)因此，作為載體的質(zhì)粒應(yīng)該是松弛型的。DNA連接酶的連接反應(yīng) (兩種插入方向 ) +第三節(jié) 分子克隆的質(zhì)粒載體 一、質(zhì)粒的一般生物學特性；二、質(zhì)粒 DNA的分離與純化；三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建及類型；四、常用質(zhì)粒載體舉例；一、質(zhì)粒的一般生物學特性（一）、質(zhì)粒 DNA 質(zhì)粒 是細菌染色體外能夠自主復制的環(huán)形雙鏈的 DNA分子。DNA連接酶　　　　　　 或 TCGAPOHA5’3’TT平端的連接比粘性末端的連接要困難得多，所需的酶量也多相同或相容粘性末端的連接只連接 ds特點： 3’3’5’3’主要用于 DNA的體外擴增，經(jīng) 25次循環(huán)后才進入酶的反應(yīng)穩(wěn)定期，一個 DNA用途：無 dNTPDNA末端修飾 缺失5’ →3 ’ 聚合酶活性， 15001.和 3)常用大片段（二）、 polIK)3’DNaseI與Pol用途, HOOH339。ExoIII c3P539。HOOH339。P339。在一定條件下， ExoIII不能作用 GC富集區(qū) (來自于 cDNA加尾 )dsDNA結(jié)構(gòu) :外切酶活性特點dsDNA， pHkD