【正文】 2）指示外源 DNA分子 是否插入載體分子 形成了重組子。Apr抗性基因編碼一種分泌到細菌細胞周間質的酶，可特異地 切割 氨芐青霉素的 β— 內酰胺環(huán)，使氨芐青霉素失活。這兩個部分可獨立存在， 分別由兩個基因編碼。 上述兩例中的非重組子來源有兩個： a. 酶切反應時仍未被作用的 pBR322或 pUC18分子 b. 酶切后的載體分子經自我連接又形成載體分子 Vectors pB R32 2B a m HIS a l IH i n d I I IP s t IS c a I A m pro r i(4. 36 k b)E c o S ac Kp n S m a B am X b a S al P s t S p h Hi nRI I I I HI I I I I d I I IpU C 1 8pU C 1 9Hi n S p h P s t S al Xb a B am S m a K p n S ac E c od I I I I I I I HI I I I RIApO r iL a c Z( )rpUC18和 pUC19載體 普通型載體 pBR322的結構圖 （ 2）、 表達型載體（ expression vector） 1) 特點 : a. 基因的啟動子序列和終止子序列； b. 一般無檢測標記基因； c. 克隆位點是確定的（即位于啟動子序列后）； d. 重組分子用凝膠電泳檢出（依賴于分子量差異）。 其 MCS區(qū)與 M13mp噬菌體載體的相同，可使 pUC上克隆的目的基因直接轉移到 M13mp載體，進行 DNA測序和體外突變等研究。 2023年 1月 23日星期一 上午 11時 48分 47秒 11:48: 1比不了得就不比，得不到的就不要。 11:48:4711:48:4711:48Monday, January 23, 2023 1不知香積寺，數里入云峰。 11:48:4711:48:4711:481/23/2023 11:48:47 AM 1越是沒有本領的就越加自命不凡。 上午 11時 48分 47秒 上午 11時 48分 11:48: MOMODA POWERPOINT Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Fusce id urna blandit, eleifend nulla ac, fringilla purus. Nulla iaculis tempor felis ut cursus. 感 謝 您 的 下 載 觀 看 專家告訴 。 11:48:4711:48:4711:48Monday, January 23, 2023 1知人者智，自知者明。 2023年 1月 23日星期一 上午 11時 48分 47秒 11:48: 1楚塞三湘接，荊門九派通。 2023年 1月 上午 11時 48分 :48January 23, 2023 1行動出成果，工作出財富。mRNA生存時間短 ， 技術要求高 由氨基酸序列合成 據推測出的核苷酸序列，通過化學方法合成 專一性最強 ，目的基因不含內含子 ，可合成自然界不存在的基因 目前 ， 復雜的尚不知核苷酸序列的基因不能合成 供體細胞中 DNA 限制性酶 運載體 DNA片段 不同受體細胞 DNA片段擴增 找出 目的基因細胞 目的基因 mRNA 逆轉錄 單鏈 DNA 合成 雙鏈 DNA 獲取目的基因的方法 重組 DNA操作過程示意圖 Cloning Strategies for Identifying Specific Genes 靜夜四無鄰，荒居舊業(yè)貧。 具有兩種抗菌素抗性基因可供轉化子的選擇記號。這兩個基因（ LacZ和 LacZα）均可作為標記基因。 Cmr基因編碼氯霉素乙酰轉移酶，使氯霉素 乙?；?，導致乙酰化的氯霉素不能結合在核糖體上。 **有的遺傳標記基因可以完成上述兩項作用。 3. 第三階段：進一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如 M13mp系列載體，含 T3， T7， sp6啟動子載體，表達型載體及各種探針型載體。 （二）、質粒的拷貝數與不親和性 質粒的拷貝數是指某種質粒在一個細菌細胞內的數目。 限制酶與其它酶共同作用結果 。 CTCGGG。 2. Ⅱ 型 ：限制與修飾基因產物獨立起作用，在 Ｅ . coli中這兩種基因位于質粒上。 ? 重組 DNA技術 (rebination DNA technique) ? 克隆 (clone): 作名詞時指含有某目的 DNA片段的重組DNA分子或含有該重組分子的無性繁殖系 . 基因工程的概念 二、基因工程的主要內容或（步驟） 從復雜的生物有機體基因組中，經過酶切消化或 PCR擴增等步驟，分離出帶有目的基因的 DNA片段。 ? 基因操作 (gene manipulation)。 基因工程中的工具酶 （一）、限制修飾系統的種類 1. Ⅰ 型 ：由三個基因構成， hsdR； hsdM； hsdS（ host specificity for DNA restriction modification and specificity）位于染色體上，三個基因構成一個復合體，限制酶需要 ATP、 Mg2+、SAM（５ — 腺苷甲硫氨酸），無特異切割位點。在進行 DNA重組時，應用限制酶同時切割目的基因和載體 DNA，使之產生相對的粘 性末端，然后再將二者連接成重組 DNA分子 基因工程中的工具酶 EcoR Ⅰ 5’ GAATTC3’ 3’ CTTAAG5’ Palindrome 5’ GOH PAATTC3’ 3’ CTTAAP HOG5’ Cohesive Ends (Sticky Ends) 基因工程中的工具酶 SmaI 5’ CCCGGG3’ 5’ CCC GGG3’ 3’ GGGCCC5’ 3’ GGG CCC5’ Blunt Ends 基因工程中的工具酶 ３） 平齊末端 SmaI 5’ CCCGGG3’ 5’ CCC GGG3’ 3’ GGGCCC5’ 3’ GGG CCC5’ ４）非互補的粘性末端 ａ）切點在識別順序之外的，如： FokI Fok I 5’ GGATG(Ｎ )93’ 5’ GGATG(N)9 3’ CCTAC(Ｎ )135’ 3’ CCTAC(N)13 ｂ）能識別簡并順序的，