基因工程原理(編輯修改稿)
2025-01-25 17:52 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 。外切酶活性： 3’→ 5’，產(chǎn)生 5’單磷酸核苷酸和具各種結(jié)構(gòu)的 dsDNA， pH2)核酸酶 H活性：除去 DNARNA雜交分子中的RNA分子， pH3)3’磷酸酶活性：除去 3’磷酸基后形成 3’OH端，有利于 DNA聚合酶反應(yīng)， pH4)內(nèi)切酶活性：在無嘌呤或無嘧啶處將 DNA鍵切開， pH3.外切酶活性特點1)反應(yīng)底物：互補 dsDNA2)堿基釋放速度： CATG3)反應(yīng)產(chǎn)物： 5’單磷酸核苷和具缺口或 5’端突起的dsDNA，過度反應(yīng)將導(dǎo)致 DNA降解4.用途 1)核酸（ DNA）標(biāo)記2)基因突變 缺失3)DNA序列測定時作順序缺失5.使用注意事項1)正式使用前，測定在一定條件下酶的反應(yīng)速度2)在一定條件下， ExoIII不能作用 GC富集區(qū) (來自于 cDNA加尾 )dsDNA結(jié)構(gòu) :切口 ,缺口 ,斷口缺口 (gap)切口 (nick)斷口 (cut)339。HOP539。 339。HOP539。539。P 539。P539。P 539。P539。P339。HO 339。HO339。HO339。HO339。HO339。HO339。HO339。HOOH339。 OH339。OH339。OH339。P539。P539。 P539。P539。P539。P539。P539。339。HOP539。OH339。P539。RNaseHExoIII的外切酶和 RNaseH的作用1234abc 1234abc1234abc1234abc1234abc234abc34abc4abcabcExoIII用于順序缺失ExoIII ExoIII [α 32P] [α 32P] dCTP dCTP 539。PP539。539。PP539。339。HOOH339。339。HOOH339。ExoIII用于DNA標(biāo)記（二）、 Rnase（三）、 RNaseH（二）、 RNase大部分用于 RNA的核苷酸序列分析或除去 DNA樣品或蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的 RNA分子。1.RNaseA分離自牛胰臟，對熱穩(wěn)定，抗去污劑（ 100℃加熱 15min仍具活性） ,用于除去 DNA樣品中的 RNA分子2.核酸酶 S7， 亦稱微球菌核酸酶，對 RNA敏感，用于除去蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的內(nèi)源 mRNA（三）、 RNaseH作用于 DNARNA雜交分子中的 RNA鏈，用于 cDNA文庫建立時除去 RNA鏈以便第二條鏈 cDNA鏈的合成。 （四）、 DNaseI1.特點： 具內(nèi)切酶活性，作用于 dsDNA，但無核苷酸序列特異型，產(chǎn)生 5’P低聚核苷酸 。Ca2+,Mg2+或 Ca2+,Mn2+可使酶活達(dá)最大值當(dāng)酶濃度很低時， dsDNA分子上將形成切口，不同類型二價陽離子對兩條鏈上切口位置形成有以下影響： Mg2+存在時，兩條鏈上的切口獨立無關(guān)， Mn2+存在時，兩條鏈上的切口幾乎在同一位置2.用途1)切口移位，制備 DNA探針2)制備 RNA樣品時除去 DNA分子3)基因突變時產(chǎn)生切口 Mn++存在時 Mg++存在時 DNaseI作用特點DNaseIHOP 5’3’5’3’5’3’DNaseI與PolI的切口移位 PolI四、 DNA聚合酶（一）、 DNA聚合酶 I（ polI）1.的 DNA聚合酶系統(tǒng)PolI參與 DNA修復(fù) ,具 3’→5’ 和 5’ →3 ’ 外切酶活性polII同上 具 3’→5’ 外切酶活性polIII參與 DNA復(fù)制 ,具 3’→5’ 和 5’ →3 ’ 外切酶活性2.polI的特點 1）具兩種外切酶活性和 DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，該酶分裂成兩個大小不同的片段，其中小片段具 5’ →3 ’ 外切酶活性，大片段具 3’→5’ 外切酶活性 (大片段亦稱為 Klenow片段 ,polIK)2） 聚合酶活性， 5’ →3 ’ ,要求 3’ OH引物和模板 DNA，其延續(xù)性受反應(yīng)條件的影響3） 外切酶活性 3.用途 1） 除去 3’端突起的單鏈 DNA（在無 dNTP時）2） 補齊 5’突起端3） 合成第二條 cDNA4） 切口移位制備探針 其中用途 2)和 3)常用大片段（二）、 T4DNA聚合酶1.特點：5’ →3 ’ 聚合酶活性， 1500nt/min,為 polI的兩倍 3’→5’ 外切酶活性，可作用于 ssDNA和 dsDNA,其切除速度分別為 40和 4000nt/min2.用途：制備高比活性探針 (1010cpm/μgDNA)。DNA末端修飾 缺失外切酶活性 聚合酶活性 無 dNTPdNTP（三）、 TaqDNA聚合酶1.特點：分離自水生棲熱菌，分子量為 94,000，最適反應(yīng)溫度 75℃ ， 對 95℃ 高溫具良好穩(wěn)定性，該酶不存在3’→ 5’外切酶活性2.用途：主要用于 DNA的體外擴增，經(jīng) 25次循環(huán)后才進(jìn)入酶的反應(yīng)穩(wěn)定期，一個 DNA分子因而可被擴增 4106倍。DNA擴增技術(shù)又稱為 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) ，它包括以下三個步驟：DNA模板變性 (95℃) → 與 DNA引物退火 (45℃ )→ 引物延伸 (75℃) TaqPol和 PCR 5’3’變性 3’5’5’3’引物 3’5’復(fù)性 5’3’5’3’3’5’引物 3’5’5’3’延伸 5’3’3’16
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