【正文】 eI用途 2.DNA聚合酶1.DNA擴增技術(shù)又稱為 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) ，它包括以下三個步驟：引物延伸 (75℃) Taq5’復(fù)性 引物 PAGCTTHOA5’HOA退火T3’TTCGAPOHA5’質(zhì)粒 DNA不僅能在細(xì)菌中復(fù)制，并且在添加真核復(fù)制信號和啟動子后，可以構(gòu)建出能在原核和真核細(xì)胞中均可復(fù)制的穿梭質(zhì)粒，并在真核細(xì)胞中表達(dá)，因此這類載體在基因工程中應(yīng)用廣泛。二、質(zhì)粒 DNA的分離與純化（放在實驗中講）三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建及類型（一）質(zhì)粒載體的發(fā)展概況；（二）質(zhì)粒載體的特點（基本條件）；（三）遺傳標(biāo)記基因（四）質(zhì)粒載體的類型（一）發(fā)展概況pBR313和 pBR322第二階段： 增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。至少應(yīng)有一個遺傳標(biāo)記基因，以指示載體或重組 DNA分子是否進入宿主細(xì)胞。 Tetr2）指示外源 DNA分子 是否插入載體分子 形成了重組子。TetracyclineAmpr Cmr） 該蛋白質(zhì)可分為兩部分： α鏈和 β鏈。β鏈）互補，產(chǎn)生有活性的 β— 半乳糖苷酶，在含有指示劑 Xgal和誘導(dǎo)劑 IPTG的存在下，菌落呈現(xiàn)蘭色；外源基因的插入后，破壞了 lacZa.LacZα基因組或 cDNA文庫的構(gòu)建 。vector）一般無檢測標(biāo)記基因；終止子+轉(zhuǎn)錄起始區(qū) 表達(dá)外源基因以產(chǎn)生大量外源基因產(chǎn)物四、常用質(zhì)粒載體舉例 pBR322載體 pUC載體 pBR322載體優(yōu)點：分子量較小，為 4363bp，不僅利于自身 DNA的純化，可容納的外源 DNA也較大。重組分子 Ⅱ Tcr轉(zhuǎn)化子影印到 Tc平板上 TcS為重組子Apr每一種限制性內(nèi)切酶會產(chǎn)生不同的粘性末端，可選用兩種內(nèi)切酶組合在質(zhì)粒載體和外源 DNA上產(chǎn)生相同的末端，進行雙粘端連接，既提高克隆的效率，又可以定向克隆。 三者均有限制 修飾系統(tǒng)和重組基因缺陷，外源 DNA可存活，且不發(fā)生重組2） 三月 21三月 21Thursday, 20:43:4220:43:4220:43Thursday,三月 20231行動出成果，工作出財富。 三月 21三月 21Thursday, 20:43:4220:43:4220:43Thursday,三月 20231少年十五二十時，步行奪得胡馬騎。 三月 21三月 21Thursday, 20:43:4220:43:4220:43Thursday, 1120231業(yè)余生活要有意義，不要越軌。POWERPOINTLoremFuscepurus.cursus.ac,adipiscing下午 8:43下午 三月 2120:43March11,PM1越是沒有本領(lǐng)的就越加自命不凡。下午 8:43下午 三月 2120:43March20231意志堅強的人能把世界放在手中像泥塊一樣任意揉捏。PM1成功就是日復(fù)一日那一點點小小努力的積累。下午 8:43下午 三月 2120:43March20231他鄉(xiāng)生白發(fā)，舊國見青山。PM1以我獨沈久，愧君相見頻。 載體容量 M13mp載體 4 kb 細(xì)菌質(zhì)粒載體 10kb λ 載體 23kb cos質(zhì)粒載體 48kb P1載體 95 kb pYAC載體 ∽1000 kb5.如常用于基因工程的宿主菌 ，菌株不同，基因型亦不同，不同載體要求不同菌株。 （ 2）、含易于檢測是否有外源 DNA插入的標(biāo)記基因 LacZα ，可利用 ?互補原理進行藍(lán)白篩選。涂布 Tc平板 Apr轉(zhuǎn)化子 分別轉(zhuǎn)化 (ApS外源 DNABamHI片段重組分子 I表達(dá)載體的類型也就確定了。終止子（常稱之為表達(dá)分泌型載體）三種表達(dá)型載體結(jié)構(gòu)圖表達(dá)單元 外源基因表達(dá)基因的啟動子序列和終止子序列；pBR322和 pUC載體。2)個用于轉(zhuǎn)化體選擇，另一個用于重組子檢測。 質(zhì)粒型載體 — 環(huán)狀 dsDNA分子，自主復(fù)制 （ 2） .αPb.這兩個基因（ LacZ和 LacZα）均可作為標(biāo)記基因。β— 半乳糖苷酶基因有 1021卡那霉素 (Kanr),氯霉素抗性基因 （ 2)至少應(yīng)有一個克隆位點，以供外源 DNA插入。2.colE1,在細(xì)胞的增殖構(gòu)成中，其中必然有一種會被逐漸地排斥（稀釋）掉。 R質(zhì)?？蓪⑵淇剐赞D(zhuǎn)移到缺乏該質(zhì)粒的適宜的受體細(xì)胞，使后者也獲得同樣的抗菌素抗性能力。5’AAGCTTT3’5’AHOPAGCTTCGAPOHA2)5’ 五、連接酶（一）、 T4延伸 3’5’3’ 與 DNA引物退火 (45℃ )為 polT4切口移位制備探針 合成第二條 cDNA補齊 5’突起端除去 3’端突起的單鏈 DNA（在無 dNTP時）polI的切口移位 Pol基因突變時產(chǎn)生切口 當(dāng)酶濃度很低時， ds2+DNaseH用于除去 DNA樣品中的 RNA分子PP539。4P539。OH339。HO339。P539。P539。切口 (nick)缺口 ,2)1)改變某些限制酶識別順序的特異性，以便重組體的形成順序完全重疊 CGG三個系統(tǒng)中的甲基化酶可使細(xì)菌 DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤發(fā)生甲基化，形成 5’甲基胞嘧啶和 6’甲基腺嘌呤。GGGGTACCCCGGG。5’CCC３） AA３）對稱性 — 雙 對稱CCGGN’N’N’N’N’CCGGGGCCGGATCC： PpuMIⅢSacIRI狹義指 II型限制酶。modification其它酶類 用于生物細(xì)胞的破壁，轉(zhuǎn)化，核酸純化，檢測等一、限制性內(nèi)切酶（一）、限制修飾系統(tǒng)的種類（二）、限制性內(nèi)切酶的定義、命名（三）、限制酶的特點（四）、異源同序酶（ isoschizomer，同裂酶）（五）、 中藥新劑型第二節(jié) 基因工程中的工具酶限制性內(nèi)切酶 — 主 要用于 DNA分子的特異切割 中藥藥靶 （基因）或作用位點基因的尋找由單個質(zhì)量性狀基因向多基因數(shù)量性狀轉(zhuǎn)變。移植 19皮膚病 22艾滋病及相關(guān)疾病 26神經(jīng)系統(tǒng)疾病 心臟病 產(chǎn)品數(shù)量感染性疾病 疾病種類 發(fā)酵工程技術(shù)發(fā)酵對象： 酶工程的主要內(nèi)容酶的分離純化酶與細(xì)胞的固定化技術(shù)及反應(yīng)器酶制劑的發(fā)酵生產(chǎn)酶分子化學(xué)修飾、遺傳突變及結(jié)構(gòu)改造酶抑制劑與激活劑開發(fā)與研究人工設(shè)計與合成模擬酶及酶分子發(fā)酵工程概念蛋白質(zhì)氨基酸序列的分析三、基因工程技術(shù)及其應(yīng)用轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因動物作為生物發(fā)生器基因本身也是一個產(chǎn)業(yè)Rockfellertechnique)克隆 (clone):基因克隆 (gene目的基因的分離第五節(jié) 基因克隆的質(zhì)粒載體第四節(jié) engineering)。DNA將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。隨著科學(xué)的發(fā)展，尤其是基因工程技術(shù)的日趨完善，為酶工程賦予了新的內(nèi)容，特別是利用 DNA操作技術(shù)，修飾改造酶分子的結(jié)構(gòu)或活性位點、酶與底物作用位點，重組酶的生產(chǎn)，模擬酶的人工設(shè)計與合成等成為新的內(nèi)容。發(fā)酵工程屬于生物技術(shù)的下游技術(shù)，是工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞、生產(chǎn)生物制品的一種技術(shù)。新型食品；營養(yǎng)食品；保健食品；輕工用酶 如美國 Amgen公司，首次開發(fā)上市的 EPO、 GSCF到 1997年的銷售額分別接近和達(dá)到 20億美元基因工程試劑的高回報堿性成纖維細(xì)胞生長因子 231元 /ug紅細(xì)胞生成素