基因工程原理-文庫吧
2025-12-14 17:52 本頁面
【正文】 酸純化，檢測等一、限制性內(nèi)切酶（一）、限制修飾系統(tǒng)的種類（二）、限制性內(nèi)切酶的定義、命名（三）、限制酶的特點(diǎn)（四）、異源同序酶（ isoschizomer，同裂酶）（五）、 限制酶的用途（一）、限制修飾系統(tǒng)的種類1.I型 ： 由三個(gè)基因構(gòu)成， hsdR； hsdM； hsdS（hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity）位于染色體上，三個(gè)基因構(gòu)成一個(gè)復(fù)合體，限制酶需要 ATP、Mg2+、 SAM（５ — 腺苷甲硫氨酸），無特異切割位點(diǎn)。2.II型 ： 限制與修飾基因產(chǎn)物獨(dú)立起作用，在 Ｅ . coli中這兩種基因位于質(zhì)粒上。3.III型 ： 修飾酶與Ｉ型酶相同， hsdＭ與 hsdＳ基因產(chǎn)物結(jié)合成一亞單位，限制酶是獨(dú)立存在的。上述三個(gè)系統(tǒng)中，只有 II型限制酶與甲基化酶具有相當(dāng)高的核苷酸識(shí)別特異性，因而被廣泛用于基因工程中。（二）、限制性內(nèi)切酶的定義、命名1.定義 ： 廣義指上述三個(gè)系統(tǒng)中的限制酶； 狹義指 II型限制酶。2.命名 ： 限制酶由三部分構(gòu)成，即菌種名、菌系編號(hào)、分離順序?！±纾?HindⅢ 前三個(gè)字母來自于菌種名稱H. influenzae， “ ｄ ” 表示菌系為ｄ型血清型； “Ⅲ” 表示分離到的第三個(gè)限制酶。EcoRI— Escherichia coliRIHindⅢ — Haemophilusinfluensae dⅢSacI(II)— Streptomycesachromagenes I(Ⅱ )（三）、限制酶的特點(diǎn)1.識(shí)別順序和酶切位點(diǎn)１）識(shí)別４ 8個(gè)相連的核苷酸MboINGATCN； AvaIIGG(A/T)CC BamHIGGATCC： PpuMIPuGG(A/T)CCPy NotIGCGGCCGC； SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGG FokI5’ＧＧＡＴＧ (Ｎ )93’3’ＣＣＴＡＣ (Ｎ )135’外側(cè)，產(chǎn)生５ ’端突起２）富含ＧＣ３）對稱性 — 雙 對稱EcoRI5’GAATTC3’3’CTTAAG5’４）切點(diǎn)大多數(shù)在識(shí)別順序之內(nèi)，也有例外５）限制酶切后產(chǎn)生兩個(gè)末端，末端結(jié)構(gòu)是５ ’Ｐ和３ ’ＯＨ2.末端種類１） ３ ’端突起 ，個(gè)數(shù)為２或４個(gè)核苷酸Pst I5’CTGCAG3’5’CTGCAG3’3’GACGTC5’3’GACGTC5’２） ５ ’端突起 ，個(gè)數(shù)為２或４個(gè)核苷酸 EcoRI5’GAATTC3’5’GOHPAATTC3’3’CTTAAG5’3’CTTAAPHOG5’粘性末端能與另一個(gè)相同的粘連末端相連接，任何兩個(gè)具有相同識(shí)別位點(diǎn)的 DNA分子經(jīng)限制酶切割后能夠重新連接成新的重組 DNA分子。在進(jìn)行 DNA重組時(shí)，應(yīng)用限制酶同時(shí)切割目的基因和載體 DNA，使之產(chǎn)生相對的粘性末端，然后再將二者連接成重組 DNA分子３） 平齊末端SmaI5’CCCGGG3’5’CCCGGG3’3’GGGCCC5’3’GGGCCC5’４）非互補(bǔ)的粘性末端ａ）切點(diǎn)在識(shí)別順序之外的，如： FokI FokI5’GGATG(Ｎ )93’5’GGATG(N)93’CCTAC(Ｎ )135’3’CCTAC(N)13ｂ）能識(shí)別簡并順序的，如： AvaIAvaI5’CPyCGPuG3’CCCGGG。CTCGGG。CCCGAG。CTCGAG（四）、異源同序酶（isoschizomer，同裂酶）1.定義：能識(shí)別相同序列但來源不同的兩種或多種限制 酶2.特點(diǎn)： 1）識(shí)別相同順序2）切割位點(diǎn)的異同 KpnIGGTACCAsp718GGTACC SstICCGCGGSacICCGCGG（五）、 限制酶的用途1.DNA重組2.限制酶（物理）圖譜繪制3.突變分析（ RFLP分析）4.限制酶的部分酶切與完全酶切附： IIS型限制酶的特點(diǎn)1.具有特異型核苷酸順序識(shí)別能力，但該順序不具有對稱結(jié)構(gòu)。2.酶切位點(diǎn)與識(shí)別位點(diǎn)不一致，切點(diǎn)常在識(shí)別位點(diǎn)的一側(cè)， 120nt。3.酶切后的末端經(jīng)補(bǔ)平后又可發(fā)生酶切反應(yīng)。4.產(chǎn)生粘性末端可以是 15個(gè)核苷酸。5.均為單體，分子量為 47—108kD 。酶切圖譜的構(gòu)建（ a）請構(gòu)建該環(huán)狀DNA分子的酶切圖譜酶切圖譜的構(gòu)建（ b）二、 DNA甲基化 酶（ 一）、 甲基化酶的種類與識(shí)別順序1.限制修飾系統(tǒng) I、 II、 III型中的甲基化酶三個(gè)系統(tǒng)中的甲基化酶可使細(xì)菌 DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤發(fā)生甲基化，形成 5’甲基胞嘧啶和 6’甲基腺嘌呤。在 DNA重組實(shí)驗(yàn)中，常用的甲基化酶屬于 II型，它與相應(yīng)的限制酶的識(shí)別順序相同，其甲基化位點(diǎn)與限制酶作用位點(diǎn)可同可不同。如： M.EcoRIGAmATTCCEcoRIGAATTC不同M． HpaICmCGGHpaICCGG相同2.II型甲基化酶對限制酶活性的影響 １） 抑制同種限制酶的活性 GGATmCC— BamHI(G?GATCC)GAmATTC— EcoRI(G?AATTC)２） 抑制不同種限制酶的活性a.順序完全重疊 如： M.ClaI（ ATCGmAT） TaqI（ TCGmA）b.順序邊界重疊 如： M.BamHI（ GGATmCC） MepI（ mCCGG）３） 抑制不同種限制酶的部分活性M． TaqI（ TCGmA） HindII（ GTPyPuAC）：GTCAAC， GTTAAC， GTCGmAC， GTTGAC3.甲基化酶的用途 １） 改變某些限制酶識(shí)別順序的特異性，以便重組體的形成２） 在建立基因文庫時(shí)，可先使 DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切 CH3CH3CH3RE RE RE RE RERE RERERE RERECH3 CH3CH3與載體相連甲基化酶人工接頭 RE用于基因組文庫的建立用于 cDNA的連接RE RE RE三、核酸酶（ 一）、外切酶 III（ ExoIII）1.一般特點(diǎn)： 來自于 ，分子量 28,000kD2.催化反應(yīng)類型1)160
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