基因工程原理-第二章dna重組(編輯修改稿)
2025-01-25 17:53 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 酸二酯鍵斷裂位置是交錯的平末端：斷裂位置在對稱軸? 切割位點表示方法5’CTGCAG3’3’GACGTC5’Pst I可以表示為：5’CTGCA ↓ G3’反應總體積： 20微升酶的用量緩沖液的組成與酶的種類有關反應時間 13小時。例： Bgl Ⅱ 對 λDNA 的消化13 mL蒸餾水 2 mL 10x緩沖液4 mL 底物 DNA1 mL RE37℃ ， 13小時依次 加入：混勻離心升溫，使酶失活（ 65℃1015min ） 除去酶蛋白限制性酶切反應一般流程底物 DNA：? DNA純度? DNA分子構(gòu)型? 識別位點側(cè)面序列? 位點偏愛? DNA甲基化酶的用量酶的活性底物 DNA：位點數(shù)量標準緩沖液的組成：緩沖液系統(tǒng)MgCl2（或醋酸鎂）NaCl（或 KCl）TrisHCl223。巰基乙醇（或二硫蘇糖醇 DTT）反應溫度： 大多數(shù)是 37℃ ，少數(shù)或高或低Star活性：某些限制性核酸內(nèi)切酶在 特定條件下 ，可以在不是原來的識別序列處切割 DNA。 限制性核酸內(nèi)切酶的 Star活性4二、 DNA連接酶DNA連接酶能催化雙鏈 DNA片段 緊靠在一起 的 3’OH和 5’P基團末端之間形成磷酸二酯鍵，使兩末端連接。如果是兩個或兩個以上不同雙鏈 DNA片段末端連接，則產(chǎn)生重組 DNA分子。 DNA連接酶缺口 nick5’5’3’3’5’5’3’3’DNA連接酶5’5’3’3’DNA連接酶裂口 gap5’5’3’3’nick（ 2）酶 AMP復合物中的 AMP與DNA鏈上的 5’P結(jié)合 ，形成 DNA腺苷酸復合物， P活躍起來（ 3） 3’OH對活躍的 P作親核攻擊，結(jié)果形成磷酸二酯鍵。（ 1） DNA連接酶與輔助因子 ATP或NAD+反應 ,生成 酶 腺苷酸 復合物 . DNA連接酶的作用機理 DNA 連接酶 T4 DNA 連接酶√√√ （但效率較低） 目前常用的 DNA連接酶? 1條 DNA鏈具有 3’OH,另 1條 DNA鏈具有 5’P,而且 3’OH與 5’P是相鄰的 .? 3’OH與 5’P位于與互補鏈上的互補堿基配對的兩個脫氧核苷酸的末端 .? 吸能反應 : DNA 連接酶 需要 NAD+， T4 DNA 連接酶 需要 ATP. DNA連接酶作用條件缺口 nick5’5’3’3’5’5’3’3’DNA連接酶5’5’3’3’DNA連接酶裂口 gap5’5’3’3’—— 反應溫度： 37℃—— 酶用量：平末端 12unit 粘性末端 ——ATP ： 10μmol/L—1mmol/L——buffer ： TrisHCl， KCl， DTT， BSADNA連接酶反應條件? 具互補粘性末端片段之間的連接? 具平末端 DNA片段之間的連接? DNA片段末端修飾后進行連接 DNA片段之間的連接方式具互補粘性末端片段之間的連接具平末端 DNA片段之間的連接DNA片段末端修飾后進行連接?DNA片段末端同聚物加尾后進行連接?粘性末端修飾成平末端后連接?DNA片段 5’ 段磷酸化作用后連接DNA片段末端同聚物加尾后進行連接粘性末端修飾成平末端后連接DNA片段 5’ 端脫磷酸化作用后連接5—— 催化以 DNA單鏈為模板 ，以 4種 脫氧核糖核苷酸 為底物，合成一條與模板序列互補的 DNA新鏈的酶。
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