第14章基因重組和基因工程--本科(編輯修改稿)
2025-01-25 14:28 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 5’…GG ▼CC...3’ Pvu Ⅱ 5’…CAG ▼CTG...3’ Sma Ⅰ 5’…CCC ▼GGG...3’ 限制性內(nèi)切核酸酶 目錄 （三）目的基因 (target gene) （ ??） ? cDNA (plementary DNA) 指經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與 RNA (通常指mRNA或病毒 RNA)互補(bǔ)的單鏈 DNA。以單鏈 cDNA為模板、經(jīng)聚合反應(yīng)可合成雙鏈 cDNA。 ? 基因組 DNA (genomic DNA) 指代表一個(gè)細(xì)胞或生物體整套遺傳信息(染色體及線粒體 )的所有 DNA序列。 目錄 （四）基因載體 ? 定義 為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些 DNA分子。 ? 常用載體 （ ??） 質(zhì)粒 DNA、噬菌體 DNA、病毒 DNA 這些載體均需經(jīng)人工構(gòu)建，除去致病基因，并賦予一些新的功能，如有利于進(jìn)行篩選的標(biāo)志基因、單一的限制酶切點(diǎn)等。 目錄 ? 載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)： ?能自主復(fù)制； ?具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定； ?有克隆位點(diǎn)（外源 DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)； ?分子量小，以容納較大的外源 DNA。 目錄 ?克隆載體 (cloning vector) 為使插入的外源 DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為 克隆載體 。 ?表達(dá)載體 (expression vector) 為使插入的外源 DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成 多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為 表達(dá)載體 。 目錄 (plasmid) 特點(diǎn) : 能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息 , 會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀 。 概念： 是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈 DNA分子，大小為 1200kb。 耐四環(huán)素基因 耐氨芐青霉素基因 目錄 ? λ噬菌體 DNA改造系統(tǒng) λgt系列（插入型，適用 cDNA克?。? EMBL系列（置換型，適用基因組克?。? (phage) ? M13噬菌體 DNA改造系統(tǒng)（含 lacZ基因） M13mp系列 線性雙鏈 DNA分子，大小約 50kb。 目錄 ? 酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC) ?柯斯質(zhì)粒載體 (cosmid vector) ? 動(dòng)物病毒 DNA改造的載體 （如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒） 目錄 以 質(zhì) 粒 為 載 體 的 DNA 克 隆 過(guò) 程 目錄 二 、 重組 DNA技術(shù)基本原理 （ ??） 目的基因的獲取 DNA導(dǎo)入受體菌 外源基因與載體的連接 克隆載體的選擇和構(gòu)建 重組體的篩選 克隆基因的表達(dá) 目錄 （一）目的基因的獲取 1. 化學(xué)合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列 。 2. 基因組 DNA文庫(kù) (genomic DNA library) 3. cDNA文庫(kù) (cDNA library) 4. 聚合酶鏈反應(yīng) (polymerase chain reaction, PCR) (見(jiàn)第 22章 ) 目錄 已知目的基因的核苷酸序列 已知基因產(chǎn)物的氨基酸序列 。 化學(xué)合成法 推導(dǎo)出編碼基因核苷酸序列 化學(xué)合成儀 合成目的基因 一般用于小分子活性多肽基因的合成。如胰島素原、 干擾素基因等。 目錄 化學(xué)合成法獲取目的基因 由已知氨基酸序列推測(cè)可能的 DNA序列。 組織或細(xì)胞染色體 DNA 基因片斷 克隆載體 重組 DNA分子 含重組分子的轉(zhuǎn)化菌 限制性內(nèi)切酶 受體菌 基因組 DNA文庫(kù) 存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組 DNA的集合 ?從基因組 DNA文庫(kù)獲取目的基因 限制酶切位點(diǎn) 限制酶消化 除去中間片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色體 DNA 限制酶部分消化 外源 DNA與載體 DNA
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