【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 NA雜合子 )收獲 T2種子 ↓ 篩選 T2，獲突變子，應(yīng)為 3:1分離 ↓ 確定 TDNA與突變型共分離的個(gè)體 ↓ 產(chǎn)生純合后代 ↓ 克隆 TDNA兩側(cè)的植物 DNA ↓ 利用側(cè)翼 DNA序列作探針從該植物的 cDNA文庫(kù)中釣取基因 ↓ 基因功能的驗(yàn)證 （三）基于 PCR的基因克隆 基于 PCR的 DNA克隆與基于載體的克隆技術(shù)相比具有一定優(yōu)越性。 ?PCR反應(yīng)速度很快，可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，而載體克隆需要幾周時(shí)間。 ?PCR反應(yīng)非常靈敏，可以用來(lái)擴(kuò)增痕量樣品的 DNA。 ?對(duì)于部分降解、甚至污染，用載體克隆無(wú)法進(jìn)行的 DNA樣品， PCR擴(kuò)增仍可獲得目的基因克隆 同源克隆 （四） 人工合成基因 ◆ 根據(jù)已知的基因或氨基酸序列，將化學(xué)合成寡核苷酸的方法與酶促合成 DNA的方法結(jié)合起來(lái)，可以很快地人工合成基因。 ◆ 例如，首先化學(xué)合成多個(gè)含有 80100個(gè)核苷酸的寡核苷酸 ，每個(gè)寡核苷酸之間具有 1924個(gè)核苷酸的重疊序列 ，再將各個(gè)寡核苷酸等量混合，在 DNA聚合酶 (或 Taq酶 )作用下，各寡核苷酸又作為引物合成新鏈，使單鏈部分補(bǔ)齊成為雙鏈，再用兩個(gè) PCR引物，經(jīng) PCR擴(kuò)增出 DNA片段。若將兩個(gè) DNA片段放在一起， 經(jīng) SOEPCR(sequence overlapped extension，SOE)擴(kuò)增出完整的基因片段。 第 3 節(jié) 外源基因?qū)胧荏w 一、重組 DNA導(dǎo)入原核生物（細(xì)菌） 二、植物表達(dá)載體 三、外源基因?qū)胫参? 一、重組 DNA導(dǎo)入原核生物（細(xì)菌） ?CaCl2處理轉(zhuǎn)化 。 CaCl2處理轉(zhuǎn)化的機(jī)制尚不清楚，可能是 CaCl2處理破壞了細(xì)菌的細(xì)胞壁，使游離的DNA分子被攝入受體細(xì)胞。這種方法的轉(zhuǎn)化頻率大概是千分之一。 ?電激轉(zhuǎn)化 （ electroporation）。是目前常用的一種轉(zhuǎn)化方式。在電轉(zhuǎn)化儀施加的強(qiáng)電場(chǎng)的作用下，使受體細(xì)胞細(xì)胞壁具有可逆的電穿孔， DNA分子進(jìn)入細(xì)胞。 ?結(jié)合（ conjugation） 。結(jié)合是原核生物細(xì)胞與細(xì)胞接觸而進(jìn)行遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移的一種自然過(guò)程。 二、植物表達(dá)載體 ◆ Ti質(zhì)粒 是一種細(xì)菌質(zhì)粒，它自然存在于土壤農(nóng)桿菌細(xì)胞中。土壤農(nóng)桿菌可感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，使之產(chǎn)生冠癭瘤 (grown gall tumors)。 致毒區(qū) Ti 質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn) 冠癭堿代謝 酶編碼基因 與 Ti 質(zhì)粒轉(zhuǎn)移功能 有關(guān)的遺傳座位 冠癭堿合成基因 T D N A 區(qū) 右邊界 生長(zhǎng)素合成基因 細(xì)胞分裂素合成基因 左邊界 ◆ Ti 質(zhì)粒。 Ti質(zhì)粒的一部分 DNA叫做 轉(zhuǎn)移 DNA（ TDNA） ，當(dāng) TDNA整合到宿主植物細(xì)胞的染色體后，就誘導(dǎo)出 根瘤 ，并使根瘤細(xì)胞合成冠癭堿 (opine),作為土壤農(nóng)桿菌的碳源和氮源 。 （ 1） TDNA區(qū)（ transferredDNA regions） TDNA是農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，從 Ti質(zhì)粒上導(dǎo)入植物細(xì)胞的一段 DNA。 ?TDNA兩端各有一段 25bp的重復(fù)序列 (LB, RB)。 TDNA攜帶的致瘤基因是一些與激素合成有關(guān)的基因，由于激素合成基因使細(xì)胞處于不停的分裂狀態(tài)，形成冠癭瘤，不能進(jìn)行細(xì)胞分化。 ?Ti質(zhì)粒改造后才能應(yīng)用于植物的基因工程。 保留TDNA兩端的末端序列，然后用外源 DNA插入或直接取代野生型 TDNA的部分基因，使轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞不具有成瘤能力。 （ 2） Vir區(qū)（ virolence region） Vir區(qū)段上的基因與 TDNA從細(xì)菌轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的遺傳過(guò)程有關(guān) ，區(qū)段上的基因能夠使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱之為 毒性區(qū) 。 Vir區(qū)段總長(zhǎng)度大約 35kb，由 7個(gè)互補(bǔ)群組成，分別命名為 VirA、 VirB、 VirC、 VirD、VirE、 VirG和 VirH。 （ 3） Con區(qū) (regions encoding conjugations) 該區(qū)段上存在著與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因（ tra），調(diào)控 Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移 。 （ 4） Ori區(qū) (origin of replication) 該區(qū)段基因調(diào)控 Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱之為 復(fù)制起始區(qū) 。 ?Ti質(zhì)粒分子受到信號(hào)分子的激活作用之后，virD基因編碼的一種核酸內(nèi)切酶，先在 TDNA的 RB序列中的第 3和第 4堿基之間切開(kāi)一個(gè) 單鏈 缺口，隨后在 TDNA同一條鏈的 LB序列中切出第二個(gè)單鏈缺口。 ?TDNA便以 單鏈形式 釋放出來(lái)，并在 RB序列的引導(dǎo)下定向地轉(zhuǎn)移到寄主植物細(xì)胞。 ?在有關(guān)的植物細(xì)胞酶體系的催化作用下，合成互補(bǔ)鏈形成雙鏈形式的 TDNA分子。 在一系列酶的參與下整合進(jìn)植物基因組。這種整合是一種非正常重組。 TDNA轉(zhuǎn)移的機(jī)制 （ 1）雙元載體系統(tǒng)（ binary vector） 具有兩個(gè)質(zhì)粒 —— 穿梭質(zhì)粒和 Ti質(zhì)粒。 （ 2）共整合載體（ integrated vector） 共整合載體系統(tǒng)包括在 TDNA上的激素合成區(qū)經(jīng)過(guò)突變后的 Ti質(zhì)粒和中間載體兩部分。 Ti質(zhì)粒的衍生載體 ?發(fā)根農(nóng)桿菌存在另一種質(zhì)粒， Ri質(zhì)粒。 ?Ri質(zhì)粒也可完成外源基因向植物的轉(zhuǎn)移工作。 發(fā)根農(nóng)桿菌侵染后植物細(xì)胞產(chǎn)生許多不定根，這種不定根生長(zhǎng)迅速，不斷分枝成毛狀，故稱之為毛狀根，也稱為發(fā)狀根，分別簡(jiǎn)稱為毛根或發(fā)根， Ri質(zhì)粒為根誘導(dǎo)質(zhì)粒。 ?Ri質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與 Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)很相似，可以分為 T區(qū)、 vir區(qū)、 ori區(qū)和其它區(qū)域等幾個(gè)部分。 Ri質(zhì)粒 T區(qū)與 Ti質(zhì)粒的 TDNA十分相似： ?① T區(qū)的左右邊界序列。左右邊界上含有25bp的重復(fù)序列。 ?② TLDNA區(qū)。該區(qū)中含有與毛狀根形成有關(guān)的 rolA、 B、 C、 D基因群。 ?③ TRDNA區(qū)。該區(qū)中含有與農(nóng)桿堿合成有關(guān)的基因（ ags）和生長(zhǎng)素合成有關(guān)的基因（ tms tms2）。 ags基因在轉(zhuǎn)化的初期起著重要的作用，是 不定根產(chǎn)生的關(guān)鍵 Ri質(zhì)粒 高等植物基因遺傳轉(zhuǎn)化的方法為兩類： ?非生物載體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化 ?種質(zhì)轉(zhuǎn)化系統(tǒng) 是以植物自身的生殖系統(tǒng)種質(zhì)細(xì)胞為受體進(jìn)行的轉(zhuǎn)化，如花粉浸泡外源 DNA、 DNA注射受粉后的子房等； ?直接轉(zhuǎn)化 是采用物理或化學(xué)方法直接將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞，如基因槍法等。 ?生物載體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。 在生物載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因是常用的方法 。 三、外源基因?qū)胫参? 需要具備如下條件： ?高效的植株再生體系。 選擇容易從體細(xì)胞再生植株的受體基因型是獲得轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵。 ?受體植物細(xì)胞對(duì)農(nóng)桿菌要有很高的親和力。 一般認(rèn)為受體細(xì)胞應(yīng)處于高度的分裂狀態(tài)， TDNA才能插入植物基因組；