基因表達(dá)和基因重組(編輯修改稿)
2025-01-25 17:44 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 能的關(guān)系 研究某基因與疾病的關(guān)系 按照人的愿望設(shè)計(jì)和建造非天然的基因表達(dá)體系。 某功能蛋白 宿主細(xì)胞 重組體 目的基因 cDNA： 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與 mRNA互補(bǔ)的 DNA鏈。 基因組 DNA： 代表一個(gè)細(xì)胞或生物體整套遺傳信息的所有DNA序列。 （四） 基因載體 定義： 為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些 DNA分子。 克隆載體 (cloning vector)為使插入的外源 DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體。 表達(dá)載體 (expression vector)為使插入的外源 DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體。 常用載體 質(zhì)粒 DNA、噬菌體 DNA、病毒 DNA 宿主細(xì)胞 基因載體 載體的選擇標(biāo)準(zhǔn) ? 能自主復(fù)制； ? 具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定； ? 有克隆位點(diǎn)（外源 DNA插入點(diǎn)）即多個(gè)單一酶切位點(diǎn)； ? 分子量小，以容納較大的外源 DNA。 存在于細(xì)菌染色體外的 小型 環(huán)狀 DNA分子。 具有 自我復(fù)制 功能。 帶有抗性基因及表型識(shí)別等 遺傳性標(biāo)記物 。 經(jīng)改造后具有 多克隆位點(diǎn) 。 舉例： pBR322質(zhì)粒 質(zhì)粒 宿主細(xì)胞 ori 抗 Amp 宿主細(xì)菌 含 Amp培養(yǎng)基 多克隆位點(diǎn) + 多種酶切口 多克隆位點(diǎn) 限制性內(nèi)切酶 單一酶切口 多克隆位點(diǎn) ori 復(fù)制起始點(diǎn) 遺傳標(biāo)記 Amp polylinker 基因載體 λ噬菌體 DNA改造系統(tǒng) λgt系列（插入型，適用 cDNA克?。? EMBL系列（置換型，適用基因組克?。? 噬菌體 (phage) M13噬菌體 DNA改造系統(tǒng)（含 lacZ基因） M13mp系列 pUC系列 粘性質(zhì)粒 (cosmid) 酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC) 細(xì)菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC) 動(dòng)物病毒 DNA改造的載體 （如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒） 其他 二 、 重組 DNA技術(shù)基本原理 基本原理 目的基因的獲取 DNA導(dǎo)入受體菌 外源基因與載體的連接 克隆載體的選擇和構(gòu)建 重組體的篩選 克隆基因的表達(dá) 以 質(zhì) 粒 為 載 體 的 DNA 克 隆 過(guò) 程 （一）目的基因的獲取 1. 化學(xué)合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列 。 DNA文庫(kù) (genomic DNA library) 3. cDNA文庫(kù) (cDNA library) 4. 聚合酶鏈反應(yīng) (polymerase chain reaction, PCR) （見第 22章） * 化學(xué)合成法獲取目的基因 由已知氨基酸序列推測(cè)可能的 DNA序列 組織或細(xì)胞染色體 DNA 基因片斷 克隆載體 重組 DNA分子 含重組分子的轉(zhuǎn)化菌 限制性內(nèi)切酶 受體菌 基因組 DNA文庫(kù) 存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組 DNA的集合 * 從基因組 DNA文庫(kù)獲取目的基因 cDNA文庫(kù) 以 mRNA 為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶合成與 mRNA互補(bǔ)的 DNA，再?gòu)?fù)制成雙鏈 cDNA，與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，即獲得 cDNA文庫(kù)。 DNA mRNA mRNA 反轉(zhuǎn)錄酶 cDNA mRNA的提取與純化 從 mRNA制備 cDNA 逆轉(zhuǎn)錄酶 ＤＮＡ聚合酶 mRNA cDNA 雜化雙鏈 cDNA文庫(kù)法
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