第13章基因重組和基因工程(編輯修改稿)
2025-01-25 15:07 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 大載體）； ②一般使用松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌里擴(kuò)增不受約束，一般 10 個(gè)以上的拷貝，而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒 10個(gè)。 ③必需具備一個(gè)以上的酶切位點(diǎn)，有選擇的余地； ④必需有易檢測(cè)的標(biāo)記，多是抗生素的抗性基因，不特指 多位 Ampr。 第三節(jié) 基因克隆的過程 制備目的基因和相關(guān)載體 將目的基因和有關(guān)載體進(jìn)行連接 將重組本 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞 DNA重組體的篩選和鑒定 DNA重組體的擴(kuò)增、表達(dá)和其他研究 目的基因 基因載體 重組體 分 切 接 轉(zhuǎn) 篩 表 總體技術(shù)路線 以 質(zhì) 粒 為 載 體 的 DNA 克 隆 過 程 1. 化學(xué)合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列 。 2. 基因組 DNA文庫 (genomic DNA library) 3. cDNA文庫 (cDNA library) 4. 聚合酶鏈反應(yīng) (polymerase chain reaction, PCR) 一、目的基因序列的來源和分離 化學(xué)合成法獲取目的基因 由已知氨基酸序列推測(cè)可能的 DNA序列。 人工化學(xué)合成法使用于： 較短的基因（ 6080bp） 用途： PCR引物 測(cè)序引物 定點(diǎn)突變 核酸雜交探針 組織或細(xì)胞染色體 DNA 基因片斷 克隆載體 重組 DNA分子 含重組分子的轉(zhuǎn)化菌 限制性內(nèi)切酶 受體菌 基因組 DNA文庫 存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組 DNA的集合 ?從基因組 DNA文庫獲取目的基因 限制酶切位點(diǎn) 限制酶消化 除去中間片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色體 DNA 限制酶部分消化 外源 DNA與載體 DNA混合 連接反應(yīng) 體外包裝 用重組噬菌體 感染大腸桿菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R cos ~20 Kb 外源 DNA 片段 基因文庫 用隨機(jī)切割的真核生物染色體 DNA片段構(gòu)建基因文庫 cDNA文庫 將 某一時(shí)間某一種類細(xì)胞 中所有的 cDNA的混合體與載體進(jìn)行連接，使每一個(gè) cDNA分子都與一個(gè)載體分子拼接成重組 DNA，將所有重組DNA分子引入宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增，得到分子克隆的混合體稱為 cDNA文庫。 mRNA cDNA 雙鏈 cDNA 重組 DNA分子 cDNA文庫 反轉(zhuǎn)錄酶 載體 受體菌 復(fù)制 ? 從 cDNA文庫獲取目的基因 逆轉(zhuǎn)錄酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶 Ⅰ 堿水解 T T T T 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR） TA克隆系統(tǒng)由 Invitrogen公司（ San Diego， CA）發(fā)展而來的商業(yè)性試劑盒，它用于 PCR產(chǎn)物的克隆和測(cè)序。 其原理是利用 Taq酶能夠在 PCR產(chǎn)物的 3’末端加上一個(gè)非模板依賴的 A，而 T載體是一種帶有 3’ T突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把 PCR產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)（ MCS）中 。 二、載體的選擇與制備 λ噬菌體和粘性質(zhì)粒適用于構(gòu)建基因組文庫， pUC系列等質(zhì)粒適合構(gòu)建 cDNA文庫和克隆一些較小的 DNA片段， M13噬菌體則用于克隆一些待測(cè)序的 DNA片段。 選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時(shí)要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點(diǎn)。如果構(gòu)建的目的基因是要表達(dá)的，則要選擇合適的表達(dá)載體。 三、重組體的連接 粘性末端的連接 利用人工接頭連接 加入同聚物尾連接 平端連接 方式： (1)同一限制酶切位點(diǎn)連接 (2)不同限制酶切位點(diǎn)連接 配伍末端連接 非配伍末端連接 1. 粘性末端連接 Bam HⅠ 切割反應(yīng) GGATCC CCTAGG T4 DNA連接酶 15186。C GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ 切割 GCC TA GGCC TA GGATCCGGATCCG載體 DNA用 Bam HⅠ 切割 GCC TA GGCC TA GGA TC CGGA TC CG重組體 GCC TA GGCC TA GGA TC CGGA TC CGGCC TAGCC TAGA TC CGGA TC CG載體自連 目的基因自連 同一限制酶切位點(diǎn)連接 不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接 GCTTAAATCTAGA ATTCGGATCTAGAATT CCT TAAG AGA TCTTC TAGAEco RⅠ 切割位點(diǎn) Bg lⅡ 切割位點(diǎn) AATTC G ATC TAGA ATTCGGATCTAAATTC G ATC TAG+ EcoRⅠ + Bg lⅡ 雙酶切 Eco RⅠ + Bg lⅡ 雙酶切 GCTTAAATCTAGA ATTCGGATCTAT4 DNA連接酶 15186。C 重組體 配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。 2. 平端連接 ?限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端 ?粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端 適用于： 目的基因 載體 限制性內(nèi)切酶 限制性內(nèi)切酶 T4 DNA連接酶 15186。C 重組體 載體自連 目的基因 自連 在末端轉(zhuǎn)移酶 (terminal transferase) 的作用下 ， 在 DNA片段末端加上同聚物序列 、 制造出粘性末端 ， 再進(jìn)行粘端連接 。 3. 同聚物加尾連接 5180。 3180。 3180。 5180。 載體 DNA 5180。 3180。 3180。 5180。 目的基因 限制酶或機(jī)械剪切 限制酶 5180。 3180。 3180。 5180。 5180。 3180。 T(T)nT T(T)nT 3180。 5180。 5180。 3180。 3180。 5180。 3180。 A(A)nA A(A)nA 3180。 5180。 λ核酸外切酶 λ核酸外切酶 末端轉(zhuǎn)移酶 + dATP 末端轉(zhuǎn)移酶 + dTTP T4 DNA連接酶 15186。C 重組體 5180。
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