第十七章基因重組與基因工程geneticrecombinationand(編輯修改稿)
2024-08-28 13:26 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 堿性磷酸酶 切除 5?－ 末端磷酸 T4多聚核苷酸激酶 催化核酸 539。羥基磷酸化 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 催化 339。端合成同聚尾 第二節(jié) 基因克隆常用的載體 載體 (vector) 是指能在連接酶作用下和外源 DNA片段連接起來，并運(yùn)送到宿主細(xì)胞的運(yùn)載工具。 其化學(xué)本質(zhì)為 DNA分子 。 本節(jié)主要內(nèi)容 載體必須具備的基本條件 載體的分類 常用的載體 一、載體必須具備的基本條件 ⒈ 具有獨(dú)立復(fù)制能力 ⒉ 具備多個(gè)限制酶的識(shí)別位點(diǎn) (多克隆位點(diǎn) ) ⒊ 具有 遺傳表型或 篩選 標(biāo)記 ⒋ 有 足夠的容量 以容納外源 DNA片段 ⒌ 可導(dǎo)入受體細(xì)胞。 二、載體的分類 * （一） 克隆載體 用來克隆和擴(kuò)增 DNA片段的載體。 有質(zhì)粒 DNA、噬菌體 DNA和病毒 DNA三類 。 （二） 表達(dá)型載體 為了使插入的外源 DNA能夠表達(dá)為多肽鏈而設(shè)計(jì)的載體稱為 表達(dá)型載體 。 表達(dá)型載體 除需載體必備條件外，還需相應(yīng)的 啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、增強(qiáng)子、終止子 等表達(dá)調(diào)控構(gòu)件。 三、常用的載體 （一） 質(zhì)粒 (plasmid)： 是存在于細(xì)菌染色體外的、能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀 DNA分子。 作為克隆載體的質(zhì)粒應(yīng)具備以下特點(diǎn)： 1. 分子量相對較小，能穩(wěn)定存在于細(xì)菌體內(nèi)， 有較高的拷貝數(shù)； 2. 具有 1個(gè)以上的遺傳標(biāo)志，便于篩選； 3. 具有多克隆位點(diǎn)。 總而言之，質(zhì)粒載體應(yīng)該是一種分子量較小、高拷貝的“松弛型”質(zhì)粒，且具有一個(gè)以上遺傳標(biāo)志和多克隆位點(diǎn)的質(zhì)粒。 廣泛應(yīng)用的質(zhì)粒： pBR32質(zhì)粒、 pUC系列等 pBR322質(zhì)粒 ① 4363 bp ② 含一個(gè)復(fù)制點(diǎn) ③ 含一個(gè)抗氨卞青霉素基因(ampR) ④ 一個(gè)抗四環(huán)素基因 (tetR) ⑤ ampR和 tetR抗性基因內(nèi)各有一些限制酶的酶切位點(diǎn)，供外源基因插入 當(dāng)外源基因插入抗藥基因內(nèi)后，抗藥基因失活。AmpR→Amp 敏感 (AmpS )、TetR→Tet 敏感 (TetS). pUC系列質(zhì)粒 由 pBR322和 M13噬菌體構(gòu)建而成的雙鏈質(zhì)粒載體； （ 1） 2674bp； （ 2） 有 ampR和與 M13噬菌體 相同的多克隆位點(diǎn) （ MCS） （ 3） 有 1個(gè)來自 LacZ基因 片斷 , 編碼半乳糖苷酶 ，便于藍(lán)白篩選 (二 )λ 噬菌體 組成特點(diǎn) ： 雙鏈線狀 DNA分子， 全長 50kb， 含 66個(gè)基因， 在其分子兩端各含有12個(gè)堿基的互補(bǔ)單鏈，是天然的粘性末端，被稱為COS位點(diǎn) 。 λ噬菌體兩種生長途徑（示意圖） λ 噬菌體感染細(xì)菌后的 兩種生長途徑 溶菌性生長 噬菌體感染細(xì)菌后 ， 借助其 2個(gè) COS位點(diǎn)互補(bǔ) 成環(huán) ， 在宿主菌體內(nèi) 連續(xù)復(fù)制 ， 合成大量基因產(chǎn)物 ， 進(jìn)而裝配成噬菌體顆粒 ， 裂解宿主菌 ， 釋放出來的噬菌體又可感染其他細(xì)菌 。 溶源性生長 噬菌體感染細(xì)菌后 ， 可將自身 DNA整合 到細(xì)菌的染色體中去 ， 與之 一起復(fù)制 ， 并遺傳給子代細(xì)胞 ， 宿主細(xì)胞不被裂解 。 第三節(jié) 重組 DNA基本原理 （ DNA重組基本程序包括下列過程） 分 — 獲取目的基因和載體 接 — 目的基因與載體的連接 轉(zhuǎn) — 重組 DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞 篩 — 重組 DNA的篩選與鑒定 一、目的基因的獲?。?分 ） 目的基因 是指所要研究或應(yīng)用的基因 ， 也是需要克隆或表達(dá)的基因 。 目的基因來源 1） 制備基因組 DNA 2） 制備 cDNA 3） 聚合酶鏈反應(yīng) 4） 人工合成基因 （一）制備基因組 DNA（基因 文庫， genomic library ） 分離 、 純化基因組 DNA 在 EDTA等存在下 ， 用蛋白 ↓ RE 酶 K消化細(xì)胞 、 酚抽提； 大小不同酶切片段 常用蔗糖梯度離心或電泳 ↓ 分離酶切片斷； 分別與同樣 RE酶切的載體連接 常用噬菌體載體或質(zhì)粒載體 ↓ DNA連接酶連接； 導(dǎo)入宿主細(xì)胞 、 擴(kuò)增 導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng) 、 擴(kuò)增； ↓ 得到分子克隆混合體 用分子雜交等方法進(jìn)行鑒定、 （基因文庫） 篩選、再擴(kuò)增，分離、回收。 （二）制備 cDNA （ cDNA文庫） 分離目的基因 的 mRNA 逆轉(zhuǎn)錄生成 cDNA單鏈 水解去除 mRNA， 合成 cDNA雙鏈 水解回折處單鏈 得到平端雙鏈 cDNA 與載體連接，導(dǎo)入宿主細(xì)胞擴(kuò)增 → 構(gòu)建 cDNA文庫。 （三）聚合酶鏈反應(yīng) ( PCR) 在體外， 以目的基因?yàn)槟０?，?DNA引物、 dNTP、
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