基因工程原理與技術(shù)-植物基因工程(編輯修改稿)
2024-10-08 20:45 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 經(jīng)過珠心進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具備正常細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞。 ② 操作方法 a、柱頭切除法； b、柱頭涂抹法； c、花粉粒攜帶法。 ③ 優(yōu)點(diǎn) 操作簡單、無需組織培養(yǎng)、 避免了組培中無性變異帶來的優(yōu)良農(nóng)藝性狀喪失。但受植物花器、花期的限制。 聚乙二醇法 (PEG法 ) ① 原理 PEG可通過改變細(xì)胞膜表面的電荷，引起細(xì)胞膜透性變化，并促進(jìn) DNA與膜接觸、粘連，同時(shí) Ca2+離子與 DNA結(jié)合成 DNA磷酸鈣復(fù)合物而沉積于原生質(zhì)體的膜表面，從而促進(jìn)外源大分子進(jìn)入原生質(zhì)體。 ② 優(yōu)點(diǎn) a、實(shí)驗(yàn)成本低廉，不需要特殊的儀器設(shè)備； b、受體植物不受種類的限制； c、嵌合體很少； d、結(jié)果比較穩(wěn)定，重復(fù)性也較好； e、轉(zhuǎn)化效率較高，可達(dá) 103。 電擊法 優(yōu)點(diǎn)：操作簡便、不需制備原生質(zhì)體、轉(zhuǎn)化效率較高、無受體限制。 顯微注射法 顯微注射法是利用顯微注射 儀將外源 DNA直接注入受體細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的方法。 固定受體細(xì)胞的方法： 瓊脂糖包埋法、多聚 L賴氨酸粘連法、吸管支持法。 優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)化效率高、不受植物種類的限制 缺點(diǎn)：工作效率低、不能規(guī)?；D(zhuǎn)化、需要昂貴儀器 浸漬法 (浸泡法 ) 浸漬法 是指將葉子、胚、胚珠、子房、花粉粒、幼穗、懸浮細(xì)胞甚至幼苗等直接浸泡在外源 DNA溶液中，利用 滲透作用 把外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞并得到整合與表達(dá)的一種轉(zhuǎn)化方法。 優(yōu)點(diǎn) ： 簡單、快速、便宜、可規(guī)?；D(zhuǎn)化 缺點(diǎn) ：轉(zhuǎn)化頻率低、重復(fù)性差 其他轉(zhuǎn)化方法： 超聲波導(dǎo)入法、激光微束法、碳化硅纖維法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、病毒介導(dǎo)法、轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)法 常 用 植 物 轉(zhuǎn) 化 方 法 比 較 評(píng)價(jià)內(nèi)容 植 物 轉(zhuǎn) 化 方 法 農(nóng)桿菌法 PEG法 電擊法 微注射法 基因槍法 花粉管通道法 受體材料 外植體 原生質(zhì)體 懸浮細(xì)胞 細(xì)胞或組織 外植體 卵細(xì)胞 宿主限制 有 無 無 無 無 開花植物 培養(yǎng)條件 簡單 復(fù)雜 復(fù)雜 復(fù)雜 簡單 無 轉(zhuǎn)化頻率 102~101 105~104 105~104 102~101 103~102 101~101 嵌 合 體 有 無 無 無或有 多 無 操 作 簡單 簡單 復(fù)雜 更復(fù)雜 復(fù)雜 簡單 設(shè)備要求 便宜 便宜 昂貴 昂貴 昂貴 簡便 工作效率 高 低 低 更低 高 低 第三節(jié) 外源基因的表達(dá)、檢測與遺傳特性 一、轉(zhuǎn)基因植物的外源基因表達(dá)及其調(diào)控 轉(zhuǎn)基因沉默 是指轉(zhuǎn)入植物的外源基因不表達(dá)或表達(dá)水平很低的現(xiàn)象。 轉(zhuǎn)基因沉默的原因及其克服措施 分為 轉(zhuǎn)錄沉默 、 轉(zhuǎn)錄后沉默 ，或分為 同源依賴性沉默 、 位置依賴性沉默 。 同源依賴性沉默 是由于轉(zhuǎn)基因出現(xiàn)多拷貝而發(fā)生轉(zhuǎn)基因之間或轉(zhuǎn)基因與內(nèi)源基因之間相互作用而誘發(fā)的轉(zhuǎn)基因沉默。 位置依賴性轉(zhuǎn)基因沉默 是指由于轉(zhuǎn)基因整合到宿主基因組的一定位置而引起的轉(zhuǎn)基因失活。 ① DNA甲基化 常發(fā)生在外源基因的啟動(dòng)子區(qū)，是轉(zhuǎn)錄沉默或位置依賴性轉(zhuǎn)基因沉默的直接誘因。 導(dǎo)致外源基因失活的機(jī)制 ： a、甲基化序列與甲基化 DNA結(jié)合蛋白結(jié)合，后者再與協(xié)同抑制蛋白 mSin3A、組蛋白去乙酰酶等形成多蛋白抑制復(fù)合物，阻礙了轉(zhuǎn)基因啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子的接觸，從而引起轉(zhuǎn)錄抑制。 b、甲基化導(dǎo)致 DNA構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)?Z型，從而降低轉(zhuǎn)錄水平，造成轉(zhuǎn)基因失活。 ② 多拷貝整合 重復(fù)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因沉默 是指外源基因多拷貝整合而引起轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平降低或失活的現(xiàn)象。 順式失活 是指相互串聯(lián)或緊密連鎖的轉(zhuǎn)基因間產(chǎn)生的失活。 反式失活 是指非同一染色體上轉(zhuǎn)基因間引起的失活。 導(dǎo)致外源基因失活的機(jī)制 ： a、 轉(zhuǎn)基因間異位配對(duì)，形成三鏈或四鏈結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致染色體異染色質(zhì)化，阻礙了轉(zhuǎn)錄因子與轉(zhuǎn)基因啟動(dòng)子的結(jié)合，從而使轉(zhuǎn)錄受到抑制； b、 轉(zhuǎn)基因 mRNA的特異降解 (空載 tRNA觸發(fā)機(jī)制 、 反義RNA觸發(fā)機(jī)制 )。 ③ 位置效應(yīng) a、外源基因整合在異染色質(zhì)區(qū)和轉(zhuǎn)錄不活躍區(qū)域 (占植物基因組 90%)； b、 外源基因整合在 非等容線位點(diǎn) ，被宿主的特定識(shí)別機(jī)制識(shí)
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