【文章內(nèi)容簡介】 1. Antibiotic screening (抗生素選擇 )： only the rebinant plasmids grow on the antibioticcontaining plate. 2. Bluewhite screening (藍(lán)白斑選擇 ): DNA insertion in the vector shuts down the LacZ gene expression, and turns the colony to white. 3. Colony hybridization screening (菌落雜交篩選 ) from a library. Antibiotic screening： only intact plasmids grow on the antibioticcontaining plate. 篩選方法 1：抗生素選擇 Ampr ori pUC18 (3 kb) MCS (Multiple cloning sites, 多克隆位點(diǎn)） Lac promoter lacZ’ Insertion of a DNA fragment interrupts the ORF of lacZ’ gene, resulting in nonfunctional gene product that can not digest its substrate xgal. 篩選方法 2：藍(lán)白斑篩選 Transfer to nitrocellulose or nylon membrane Denature DNA(NaOH) Bake onto membrane Probe with 32plabled DNA plementary to gene of interest Expose to film Select positive from master plate Keep master plate Screening by plaque hybridization 篩選方法 3：菌落原位雜交 Analysis of a clone 1. Restriction mapping: digestion of the plasmid prepared from a clone with restriction enzymes to investigate if the interested DNA is inserted the rebinant plasmid. 2. Sequencing the cloned DNA to see if the inserted DNA maintains the correct sequence. Restriction mapping Nco I Xho I Sequencing 富集的混合培養(yǎng)物 研究結(jié)果 黏附在纖維素上的菌群 A B Cafedcb研究結(jié)果 ?一類球菌通過絲狀物質(zhì)黏附在纖維素上； ?細(xì)菌降解濾紙后在纖維上形成孔洞，且與菌體形態(tài)類似， 通過絲狀物質(zhì)與孔壁相連； ?黏附在纖維素上的球菌可能為纖維素降解菌 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹 研究結(jié)果 ? 原核生物通用引物 530f/1492r ? 克隆數(shù) :49個(gè)， 57%為未培養(yǎng)細(xì)菌 ? OUT: 16S rRNA97% 7個(gè) OTUs: RFC1～ RFC7 97% 98% 98% 97% 95% 97% 99% 安，木聚糖 纖維素降解環(huán)境 乳桿菌 纖維素降解環(huán)境 來自牦牛（安） 產(chǎn)甲烷菌 基因表達(dá) 69 Expression vectors: allowing the exogenous DNA to be stored and expressed in an anism. E. coli expression vector Yeast expression vector Mammalian expression vector Features: In addition to the origin of replication, selective marker, multiple cloning site, expression vector has to contain a promoter and terminator for transcription. The inserted gene has to have a start codon and a stop codon for translation 表達(dá)載體： pET28a 外源基因表達(dá)策略 ? 目標(biāo)基因的 PCR擴(kuò)增； ? 連接克隆載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞； ? 篩選陽性克隆子并測序鑒定； ? 酶切陽性克隆子和表達(dá)載體； ? 連接目的基因和表達(dá)載體； ? 重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株； ? IPTG誘導(dǎo)外源基因表達(dá)； ? SDSPAGE鑒定表達(dá)情況。 外源基因表達(dá)蛋白的 SDSPAGE Fusion proteins Gene cloning and expression provides a very powerful way to obtain a large amount of the target protein fused with an enzyme, fluorescence protein or a tag for identification (鑒定 ) or purification (純化 ). Examples Lac fusions (Enzyme) : fuse your target gene with the LacZ coding sequence. Histag fusions (Tag) : A sequence encodes Histag was inserted at the N or C termini of the target ORF, allowing the fusion protein to be purified by binding to Ni2+ column. GFP fusions (Fluorescence protein): insert your targeted gene at the N or C termini of GFP (green fluorescence protein, 綠色熒光蛋白 ), and your fusion protein will give you green fluorescence signal. DNA 測序 ? 兩種測序方法： ? 1. Maxam and Gilbert：化學(xué)修飾法 很少應(yīng)用； ? 2. Sanger：雙脫氧法，鏈終止法（ Chaintermination method），廣泛應(yīng)用。 鏈終止法 (Chaintermination method ) 理論基礎(chǔ)： ? DNA聚合酶能利用單鏈 DNA為模板，準(zhǔn)確合成 DNA的互補(bǔ)鏈 ? DNA聚合酶能夠利用 2’ ,3’ 雙脫氧核苷酸 ddNTPs作底物，使之連接到核苷酸鏈的 3’ 末端，從而終止 DNA鏈的生長。 雙脫氧核苷酸對(duì) DNA聚合酶的抑制機(jī)理： ddNTPs的核糖基團(tuán)上 C2和 C3的羥基被 H取代，當(dāng)ddNTPs加到核苷酸鏈上之后，后來的核苷酸不能形成新的磷酸二酯鍵，從而終止鏈的合成。 四個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)體系： dNTP+ ddGTP, dNTP+ ddATP dNTP+ ddCTP, dNTP+ ddTTP 每個(gè) ddNTP都帶有一個(gè)獨(dú)特的熒光信號(hào)，可以從電泳之后的凝膠上讀出。 Automatic sequencer 1. Fluorescence Labeled ddNTP 2. Polymerase catalyzed 技術(shù)路線與要求 制備單鏈模板 ↓ 將單鏈模板與一小段引物退火 ↓ 加入 DNA多聚酶 4種脫氧核苷酸 分別加入少量 4種雙脫氧核苷酸 ↓ 將 4種反應(yīng)產(chǎn)物分別在 4條泳道電泳 ↓ 根據(jù) 4個(gè)堿基在 4條泳道的終止位置讀出基因序列 鏈終止法對(duì) DNA聚合酶的要求 ? 高酶活性： 保證不會(huì)反應(yīng)提前終止； ? 無 5’ →3 ’外切酶活性： 保證不切除新合成鏈的 5’端，改變鏈長度，給讀序造成誤差； ? 無 3’ →5 ’外切酶活性： 證不切除新合成鏈的 3’端，改變鏈長度，給讀序造成誤差； 測序的 DNA聚合酶 目前普遍采用的測序酶為 Sequenase, 來自 T7噬菌體 1. 將 DNA克隆到質(zhì)粒載體 ? 這種方法是獲得測序模板 DNA最常用的方法。 2. 獲得的 DNA通過熱變性或者堿變性轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂?DNA進(jìn)行測序。 ? 優(yōu)點(diǎn)：可雙向測序。 ? 缺點(diǎn)：樣品可能有少量細(xì)菌的 DNA或者 RNA污染，會(huì)干擾測序。 鏈終止反應(yīng)要求單鏈作為模板如何得到單鏈 DNA ？ 將 DNA克隆到 M13噬菌體載體 ? M13噬菌體載體是專 為得到單鏈 DNA測序模板而設(shè)計(jì)的。 ? M13噬菌體本來含有單鏈 DNA基因組，感染大腸桿菌的 M13可轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈復(fù)制型。 M13噬菌體載體是雙鏈的，相當(dāng)于 M13噬菌體的復(fù)制型。 ? 用含有待測序片段的 M13噬菌體載體感染大腸桿菌，大腸桿菌分泌的噬菌體就含有單鏈 DNA基因組