【文章內容簡介】 因及其復制成分 。 λ噬菌體的 cos區(qū) ,這是體外包裝必須的成分 。 。 ,不能進行體外包裝 ,有利于重組體的篩選 .72n 3. 酵母人工染色體載體 (YAC) YAC是第一個成功構建的人工染色體載體，也是目前能容納最大量 (100萬 bp)外源 DNA片段的載體 .典型的YAC載體結構及基因克隆過程如下圖所示。 7374（二）表達載體（ expressing vector） 表達載體是用來在受體細胞中表達外源基因的載體，它除了具有克隆載體所具有的性質外，還需要有能表達外源基因所必需的DNA序列 （如啟動子、核糖體結合位點和轉錄終止調控序列等）。 按宿主細胞的不同，可將表達載體又分為原核細胞表達載體、酵母細胞表達載體、哺乳動物細胞表達載體和昆蟲細胞表達載體。 75n pRSET載體 它是一個兩用載體， 它既可作為表達融合型蛋白的載體，也可作為表達非融合型蛋白的載體。該載體含有 Amp抗性基因和一個強的 T7噬菌體啟動子，在啟動子與終止信號之間有 RBS和 多克隆位點。 7677 78 n 真核表達載體 都含有一套真核表達元件，即啟動子 /增強子、克隆位點、終止信號和加工poly(A)的信號。如 （見圖 813）是常用的真核表達載體之一。該載體含有一個高效表達的 CMV啟動子、多克隆位點、原核細胞復制起始點、用于原核細胞篩選的 Amp抗性基因和真核細胞篩選的抗性基因 (Neor)及小牛生長激素的 poly(A)。 79 80 n 腺相關病毒（ Adenoassociated virus, AAV） 是一種細小病毒科依賴病毒屬的單鏈 DNA病毒?；蚪M全長 kb，共含 2個結構基因，分別編碼病毒復制和組裝必需的蛋白質?；蚪M兩端的反向末端重復序列（ ITR）是腺相關病毒復制、整合及包裝所必需的順式作用元件。 AAV載體可用于體內或體外感染肌肉、神經、肝及造血細胞，目前 多用于 ?地中海貧血等單基因遺傳病基因治療的載體。 81 n AAV載體的優(yōu)點： ① 可感染多種細胞，包括非分裂期細胞； ② 免疫原性小、毒性低和致病性弱； ③能特異地整合到人的 19號染色體中 。④ 它介導整合到人染色體中的外源基因能在人染色體中長期穩(wěn)定表達。n 其不足之處 :成熟病毒顆粒的形成需腺病毒或皰疹病毒協(xié)助和容納外源基因的容量較小（約 4kb）。n 用外源基因及其調控序列置換 AVV的結構基因，保留其兩端的 ITR結構，可構建腺相關病毒重組載體，用于基因治療。但重組 AVV大多失去了野生型病毒整合人靶細胞基因組的特異性。82第三節(jié) 基因克隆的基本過程n 基因克隆的基本過程主要應包括：① 目的基因的獲??；② 基因載體的選擇與構建；③ 基因載體與目的基因的連接 （構建 DNA重組體）；④ DNA重組體導入受體細胞；⑤ 含 DNA重組體細胞（轉化子 ）或菌落的篩選與鑒定。 83基因克隆的基本過程 載體 目的基因重組 DNA分子 細菌轉化擴增84 85一、目的基因的獲取n (一 ) 直接從基因組 DNA中分離 n (二 ) 化學合成法 n (三 ) 逆轉錄法 n (四 ) 聚合酶鏈反應 n (五 ) 從基因文庫中篩選獲得 861. 化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的 DNA序列87組織或細胞染色體 DNA基因片斷克隆載體重組 DNA分子含重組分子的轉化菌限制性內切酶受體菌基因組 DNA文庫存在于轉化細胞內由克隆載體所攜帶的所有基因組 DNA的集合2. 從基因組 DNA文庫獲取目的基因目 錄88限制酶切位點限制酶消化 除去中間片段cos L R coscos L左臂R cos右臂真核生物染色體 DNA限制酶部分消化 外源 DNA與載體 DNA混合 連接反應 體外包裝 用重組噬菌體感染大腸桿菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R cos~20 Kb 外源 DNA 片段 基因文庫目 錄89mRNA cDNA 雙鏈 cDNA 重組 DNA分子 cDNA文庫 反轉錄酶 載體 受體菌 復制 3. 從 cDNA文庫獲取目的基因 逆轉錄酶A A A A T T T T AAAASI核酸酶 DNA聚合酶 Ⅰ堿水解 T T T T目 錄90（ polymerase chain reaction,PCR）方法 n PCR實際上是一種利用酶反應在體外獲得基因組中特異的 DNA序列或 cDNA序列方法，多采用 RTPCR.n 該方法的特點是簡便、快捷、特異性強、靈敏度高，是目前分子生物學中應用最廣的新技術。n 另外 ,近來 mRNA差異顯示技術和差異蛋白質譜表達技術 也被用來篩選差異表達基因和功能基因。 915? Primer 15? Primer 2Cycle 2Cycle 15?5? 5?5? 5? 5?Template DNA5?5? 5?5?5? 5? 5?5?一、基本工作原理目 錄92Cycle 35?5? 5?5?5? 5? 5? 5?5? 5? 5? 5? 5? 5?5? 5?25～ 30 次循環(huán)后，模板 DNA的含量可以擴大 100萬倍以上。目 錄93n模板 DNAn 特異性引物n耐熱 DNA聚合酶n dNTPsn Mg2+ PCR體系基本組成成分94PCR的基本反應步驟變性95?C延伸72?C退火Tm5?C95（一）目的基因的克隆（二）基因的體外突變（三） DNA和 RNA的微量分析（四） DNA序列測定（五）基因突變分析四、 PCR的主要用途96幾種重要的 PCR衍生技術（一）反轉錄 PCR技術（二）原位 PCR技術（三）實時 PCR技術97實時 PCR技術原理目 錄98二、基因載體的選擇與制備n 基因克隆中基因載體的選擇與構建是一項技術性很強的工作，它直接影響到基因克隆的成敗。一般應從目的基因、所用限制酶及受體菌（細胞）的特性綜合考慮。 99三、 DNA重組體的構建（一）目的基因與基因載體的連接1. 粘端連接法2. 平端連接法3. 人工接頭連接法4. 同聚物加尾連接法1001. 粘性末端連接方式： (1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接配伍末端連接非配伍末端連接101Bam HⅠ 切割反應 GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶15186。CGATCC GGCCTAG+目的基因用 Bam HⅠ 切割 載體 DNA用 Bam HⅠ 切割重組體目的基因自連 載體自連同一限制酶切位點連接目 錄102不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接Eco RⅠ 切割位點 Bg lⅡ 切割位點+EcoRⅠ + Bg lⅡ雙酶切 Eco RⅠ + Bg lⅡ雙酶切T4 DNA連接酶15186。C重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。目 錄1032. 平端連接適用于： 限制性內切酶切割產生的平端粘端補齊或切平形成的平端104目的基因載體限制性內切酶限制性內切酶T4 DNA連接酶15186。C重組體 載體自連 目的基因 自連目 錄1053. 同聚物加尾連接在末端轉移酶 (terminal transferase)的作用下，在 DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。1065180。3180。3180。5180。載體 DNA5180。3180。3180。5180。目的基因限制酶或機械剪切 限制酶 5180。3180。 3180。5180。 5180。 3180。 T(T)nT T(T)nT 3180。5180。 5180。 3180。 3180。5180。 5180。 3180。 A(A)nA A(A)nA 3180。5180。λ核酸外切酶 λ核酸外切酶末端轉移酶+ dATP末端轉移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶15186。C重組體目 錄1074. 人工接頭 (linker)連接由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產生粘性末端，而進行粘端連接 。 108人工接頭及其應用CCGAATTCG GGCTTAAGC5180。3180。Eco RⅠEco RⅠEco RⅠEco RⅠ目 錄109（二）影響目的基因與載體連接的因素n 1. 連接酶的活性大小n 2. 連接反應的溫度 n 3. 目的基因與載體 DNA的比例 110 n 連接酶的抑制劑 : 目的基因與載體連接反應的實質是連接酶對兩種 DNA片段末端之間的催化反應，連接酶的活性大小直接影響到連接效果。 連接酶的活性能被 5mmol/L 磷酸鹽、 25mmol/L NaCl 和 mmol/L Ca2+離子所抑制。 所以，在連接反應中一定不能含有上述試劑，特別是當要求用高鹽緩沖液的酶消化 DNA后，必須用乙醇沉淀 DNA以除去鹽和限制酶，然后加入連接緩沖液進行連接反應。 DDT可促進 T4DNA連接酶的連接作用。111 n 連接反應條件 : 對粘性末端片段的連接反應溫度一般為 12℃ ～ 15℃，反應過夜；最適 pH為 . 對平末端片段的連接反應溫度一般在室溫（ 22℃ ～25℃ ）下進行。 ATP的失活 往往也是連接反應失敗的重要原因之一。一般配制的 4mmo