【正文】 南昌大學醫(yī)學院萬福生 Geic Engineering基因工程1n 基因工程（ geic engineering）是人們在對自然界基因重組和基因轉移的認識上發(fā)展起來的一門分子生物學技術。n 基因工程的重要特點是在分子水平上操作，細胞水平上表達。n 它的誕生和發(fā)展，不但為生命科學的理論研究提供了嶄新的技術手段，而且為醫(yī)學領域的發(fā)展開辟了廣闊的前景。 2生物技術工程 : 基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細胞工程等目的① 分離獲得某一感興趣的基因或 DNA ② 獲得感興趣基因的表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程 (geic engineering) —— 實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關的工作稱基因工程，又稱 重組 DNA工藝學 。3第 一 部分DNA的重組 DNA Rebination4DNA重組接合作用 (conjugation)轉化作用 (transformation)轉導作用 (transduction)轉 座 (transposition)同源重組 (homologous rebination)位點特異的重組 (sitespecific rebination)5發(fā)生在同源序列間的重組稱為 同源重組(homologous rebination)，又稱 基本重組 。是最基本的 DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個 DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。 以 ，了解同源重組機制的 Holliday模型。一、同源重組6Holliday模型中，同源重組主要 4個關鍵步驟 ① 兩個同源染色體 DNA排列整齊② 一個 DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應的鏈連接，形成 Holliday中間體③ 通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈 DNA④ Holliday中間體切開并修復，形成兩個雙鏈重組體 DNA，分別為：片段重組體 (patch rebinant)拼接重組體 (splice rebinant) 7片段重組體 （見模型圖左邊產(chǎn)物）： 切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側來自同一親本DNA。拼接重組體 （見模型圖右邊產(chǎn)物）： 切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側來自不同親本 DNA。 8 內(nèi)切酶 (recBCD)DNA侵擾(recA)分支遷移 (recA) 內(nèi)切酶(recBCD) DNA 連接酶5180。 3180。5180。3180。5180。3180。5180。3180。5180。 3180。5180。 3180。5180。3180。5180。3180。5180。 3180。5180。 3180。5180。3180。5180。3180。 5180。3180。5180。 3180。3180。 3180。5180。3180。5180。3180。3180。5180。5180。 3180。5180。3180。5180。3180。Holiday中間體5180。 3180。5180。 3180。5180。3180。5180。3180。目 錄9Holiday中間體5180。 3180。5180。 3180。5180。3180。5180。3180。5180。3180。 5180。5180。5180。3180。3180。3180。5180。 5180。5180。5180。3180。3180。3180。3180。5180。 5180。5180。5180。3180。3180。3180。3180。5180。 5180。5180。5180。3180。3180。3180。3180。5180。 5180。5180。5180。 3180。3180。3180。3180。內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC) DNA連接酶 DNA連接酶片段重組體 拼接重組體目 錄10二、細菌的基因轉移與重組（一）接合作用當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸時，質(zhì)粒 DNA從一個細胞（細菌）轉移至另一細胞（細菌）的 DNA轉移稱為 接合作用(conjugation)。11可接合質(zhì)粒如 F 因子 (F factor) 質(zhì)粒 —— 細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈 DNA分子12（二）轉化作用通過自動獲取或人為地供給外源 DNA，使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型，稱為 轉化作用 (transformation)。 13例： 溶菌時，裂解的 DNA片段被另一細菌攝取。14目 錄15（三）轉導作用當病毒從被感染的（供體）細胞釋放出來、再次感染另一（供體）細胞時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的 DNA轉移及基因重組即為 轉導作用 (transduction)。16λ噬菌體的生活史溶菌生長途徑(lysis pathway)溶源菌生長途徑(lysogenic pathway)例目 錄17目 錄18三、位點特異重組位點特異重組 (sitespecific rebination) 是由整合酶催化，在兩個 DNA序列的特異位點間發(fā)生的整合。例 （ 一） λ噬菌體 DNA的整合λ噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點發(fā)生選擇性整合；反轉錄病毒整合酶可特異地識別、整合反轉錄病毒cDNA的 長末端重復序列 (long terminal repeat, LTR)。 19例 （二）細菌的特異位點重組沙門氏菌 H片段倒位決定鞭毛相轉變 20hix為反向重復序列，它們之間的 H片段可在 Hin控制下進行特異位點重組 (倒位 )。 H片段上有兩個啟動子 P，其一驅(qū)動 hin基因表達，另一正向時驅(qū)動 H2和 rH1基因表達，反向 (倒位 )時 H2和 rH1不表達。 rH1為 H1的阻遏蛋白基因。21 H2鞭毛素 阻遏蛋白Hin重組酶轉位片段hin H2 I H1 H1鞭毛素hin H2 IDNA 啟動序列H1啟動序列沙門氏菌 H片段倒位決定鞭毛相轉變22例 （三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白 (Ig)，由兩條輕鏈 (L鏈 )和兩條重鏈 (H鏈 )組成，分別由三個獨立的基因族編碼，其中兩個編碼輕鏈 (?和 ?)，一個編碼重鏈。 輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：L V J C L V D J C 23重鏈 (IgH)基因的 VDJ重排和輕鏈 (IgL)基因的 VJ重排均發(fā)生在特異位點上。在 V片段的下游， J片段的上游以及 D片段的兩側均存在保守的重組信號序列 (rebination signal sequence, RSS)。此重排的重組酶基因rag (rebination activating gene)共有兩個，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì) RAG1和 RAG2。 CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCAC TGTTTTTGG重組信號序列基因片段24V片段 J片段RSS RSS間插 DNAOHOHV J單鏈切開 RAG1RAG2分子內(nèi)轉酯反應單鏈切開轉移核苷酸修復、連接免疫球蛋白基因重排過程目 錄25四、轉座重組由插入序列和轉座子介導的基因移位或重排稱為 轉座 (transposition)。26插入序列 (insertion sequences, IS)組成：二個分離的反向重復 (inverted repeats, IR)序列特有的正向重復序列 一個轉座酶（ transposase)編碼基因 IR Transposase Gene IR發(fā)生形式：保守性轉座 (conservative transposition)復制性轉座 (duplicative transposition)（一）插入序列轉座27插入序列的復制性轉座目 錄28轉座子 (transposons) —— 可從一個染色體位點轉移到另一位點的分散重復序列。 轉座子組成： 反向重復序列轉座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因IR IRTransposase Gene 有用基因（二）轉座子轉座2930由轉座子介導的轉座目 錄31第 二 部分 重組 DNA技術DNA Rebination Technique 32重組重組 DNA技術相關概念技術相關概念 克隆 (clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為 克隆化 (cloning)，即 無性繁殖 。（一） DNA克隆33技術水平： 分子克隆 (molecular clone)即 DNA 克隆 細胞克隆個體克?。▌游锘蛑参铮?4DNA克隆應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的 DNA）與載體 DNA接合成一具有自我復制能力的 DNA分子 —— 復制子 (replicon)，繼而通過轉化或轉染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱 基因克隆或重組 DNA (rebinant DNA) 。 35重組 DNA技術的發(fā)展史1865年 18661944年 1973年 美國斯坦福大學的科學家構建 第一個 重組 DNA分子1977年 美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上 第一家 遺傳工程公司，專門應用重組 DNA技術制造醫(yī)學上重要的藥物。1980年 開始建造 第一家 應用重組 DNA技術生產(chǎn)胰島素的工廠 。1997年 英國羅林研究所成功的克隆了 多莉 。36第二節(jié) 基因工程的物質(zhì)基礎 第三節(jié) 基因克隆的基本過程第四節(jié) 克隆基因的表達 第五節(jié) 基因工程技術與醫(yī)學的發(fā)展 第一節(jié) 基因工程的基本原理 37第一節(jié) 基因工程的基本原理