【正文】 南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院萬(wàn)福生 Geic Engineering基因工程1n 基因工程（ geic engineering）是人們?cè)趯?duì)自然界基因重組和基因轉(zhuǎn)移的認(rèn)識(shí)上發(fā)展起來(lái)的一門(mén)分子生物學(xué)技術(shù)。n 基因工程的重要特點(diǎn)是在分子水平上操作，細(xì)胞水平上表達(dá)。n 它的誕生和發(fā)展，不但為生命科學(xué)的理論研究提供了嶄新的技術(shù)手段，而且為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展開(kāi)辟了廣闊的前景。 2生物技術(shù)工程 : 基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等目的① 分離獲得某一感興趣的基因或 DNA ② 獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程 (geic engineering) —— 實(shí)現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱 重組 DNA工藝學(xué) 。3第 一 部分DNA的重組 DNA Rebination4DNA重組接合作用 (conjugation)轉(zhuǎn)化作用 (transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 (transduction)轉(zhuǎn) 座 (transposition)同源重組 (homologous rebination)位點(diǎn)特異的重組 (sitespecific rebination)5發(fā)生在同源序列間的重組稱為 同源重組(homologous rebination)，又稱 基本重組 。是最基本的 DNA重組方式，通過(guò)鏈的斷裂和再連接，在兩個(gè) DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。 以 ，了解同源重組機(jī)制的 Holliday模型。一、同源重組6Holliday模型中，同源重組主要 4個(gè)關(guān)鍵步驟 ① 兩個(gè)同源染色體 DNA排列整齊② 一個(gè) DNA的一條鏈斷裂、并與另一個(gè)DNA對(duì)應(yīng)的鏈連接，形成 Holliday中間體③ 通過(guò)分支移動(dòng)產(chǎn)生異源雙鏈 DNA④ Holliday中間體切開(kāi)并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組體 DNA，分別為：片段重組體 (patch rebinant)拼接重組體 (splice rebinant) 7片段重組體 （見(jiàn)模型圖左邊產(chǎn)物）： 切開(kāi)的鏈與原來(lái)斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來(lái)自同一親本DNA。拼接重組體 （見(jiàn)模型圖右邊產(chǎn)物）： 切開(kāi)的鏈并非原來(lái)斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來(lái)自不同親本 DNA。 8 內(nèi)切酶 (recBCD)DNA侵?jǐn)_(recA)分支遷移 (recA) 內(nèi)切酶(recBCD) DNA 連接酶5180。 3180。5180。3180。5180。3180。5180。3180。5180。 3180。5180。 3180。5180。3180。5180。3180。5180。 3180。5180。 3180。5180。3180。5180。3180。 5180。3180。5180。 3180。3180。 3180。5180。3180。5180。3180。3180。5180。5180。 3180。5180。3180。5180。3180。Holiday中間體5180。 3180。5180。 3180。5180。3180。5180。3180。目 錄9Holiday中間體5180。 3180。5180。 3180。5180。3180。5180。3180。5180。3180。 5180。5180。5180。3180。3180。3180。5180。 5180。5180。5180。3180。3180。3180。3180。5180。 5180。5180。5180。3180。3180。3180。3180。5180。 5180。5180。5180。3180。3180。3180。3180。5180。 5180。5180。5180。 3180。3180。3180。3180。內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC) DNA連接酶 DNA連接酶片段重組體 拼接重組體目 錄10二、細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組（一）接合作用當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過(guò)菌毛相互接觸時(shí)，質(zhì)粒 DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的 DNA轉(zhuǎn)移稱為 接合作用(conjugation)。11可接合質(zhì)粒如 F 因子 (F factor) 質(zhì)粒 —— 細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈 DNA分子12（二）轉(zhuǎn)化作用通過(guò)自動(dòng)獲取或人為地供給外源 DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱為 轉(zhuǎn)化作用 (transformation)。 13例： 溶菌時(shí)，裂解的 DNA片段被另一細(xì)菌攝取。14目 錄15（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來(lái)、再次感染另一（供體）細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的 DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為 轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 (transduction)。16λ噬菌體的生活史溶菌生長(zhǎng)途徑(lysis pathway)溶源菌生長(zhǎng)途徑(lysogenic pathway)例目 錄17目 錄18三、位點(diǎn)特異重組位點(diǎn)特異重組 (sitespecific rebination) 是由整合酶催化，在兩個(gè) DNA序列的特異位點(diǎn)間發(fā)生的整合。例 （ 一） λ噬菌體 DNA的整合λ噬菌體的整合酶識(shí)別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點(diǎn)發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地識(shí)別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的 長(zhǎng)末端重復(fù)序列 (long terminal repeat, LTR)。 19例 （二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組沙門(mén)氏菌 H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變 20hix為反向重復(fù)序列，它們之間的 H片段可在 Hin控制下進(jìn)行特異位點(diǎn)重組 (倒位 )。 H片段上有兩個(gè)啟動(dòng)子 P，其一驅(qū)動(dòng) hin基因表達(dá)，另一正向時(shí)驅(qū)動(dòng) H2和 rH1基因表達(dá)，反向 (倒位 )時(shí) H2和 rH1不表達(dá)。 rH1為 H1的阻遏蛋白基因。21 H2鞭毛素 阻遏蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段hin H2 I H1 H1鞭毛素hin H2 IDNA 啟動(dòng)序列H1啟動(dòng)序列沙門(mén)氏菌 H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變22例 （三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白 (Ig)，由兩條輕鏈 (L鏈 )和兩條重鏈 (H鏈 )組成，分別由三個(gè)獨(dú)立的基因族編碼，其中兩個(gè)編碼輕鏈 (?和 ?)，一個(gè)編碼重鏈。 輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：L V J C L V D J C 23重鏈 (IgH)基因的 VDJ重排和輕鏈 (IgL)基因的 VJ重排均發(fā)生在特異位點(diǎn)上。在 V片段的下游， J片段的上游以及 D片段的兩側(cè)均存在保守的重組信號(hào)序列 (rebination signal sequence, RSS)。此重排的重組酶基因rag (rebination activating gene)共有兩個(gè)，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì) RAG1和 RAG2。 CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCAC TGTTTTTGG重組信號(hào)序列基因片段24V片段 J片段RSS RSS間插 DNAOHOHV J單鏈切開(kāi) RAG1RAG2分子內(nèi)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)單鏈切開(kāi)轉(zhuǎn)移核苷酸修復(fù)、連接免疫球蛋白基因重排過(guò)程目 錄25四、轉(zhuǎn)座重組由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為 轉(zhuǎn)座 (transposition)。26插入序列 (insertion sequences, IS)組成：二個(gè)分離的反向重復(fù) (inverted repeats, IR)序列特有的正向重復(fù)序列 一個(gè)轉(zhuǎn)座酶（ transposase)編碼基因 IR Transposase Gene IR發(fā)生形式：保守性轉(zhuǎn)座 (conservative transposition)復(fù)制性轉(zhuǎn)座 (duplicative transposition)（一）插入序列轉(zhuǎn)座27插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座目 錄28轉(zhuǎn)座子 (transposons) —— 可從一個(gè)染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一位點(diǎn)的分散重復(fù)序列。 轉(zhuǎn)座子組成： 反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因IR IRTransposase Gene 有用基因（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座2930由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座目 錄31第 二 部分 重組 DNA技術(shù)DNA Rebination Technique 32重組重組 DNA技術(shù)相關(guān)概念技術(shù)相關(guān)概念 克隆 (clone)來(lái)自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過(guò)程稱為 克隆化 (cloning)，即 無(wú)性繁殖 。（一） DNA克隆33技術(shù)水平： 分子克隆 (molecular clone)即 DNA 克隆 細(xì)胞克隆個(gè)體克?。▌?dòng)物或植物）　34DNA克隆應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的 DNA）與載體 DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的 DNA分子 —— 復(fù)制子 (replicon)，繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子，也稱 基因克隆或重組 DNA (rebinant DNA) 。 35重組 DNA技術(shù)的發(fā)展史1865年 18661944年 1973年 美國(guó)斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建 第一個(gè) 重組 DNA分子1977年 美國(guó)南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上 第一家 遺傳工程公司，專門(mén)應(yīng)用重組 DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。1980年 開(kāi)始建造 第一家 應(yīng)用重組 DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠 。1997年 英國(guó)羅林研究所成功的克隆了 多莉 。36第二節(jié) 基因工程的物質(zhì)基礎(chǔ) 第三節(jié) 基因克隆的基本過(guò)程第四節(jié) 克隆基因的表達(dá) 第五節(jié) 基因工程技術(shù)與醫(yī)學(xué)的發(fā)展 第一節(jié) 基因工程的基本原理 37第一節(jié) 基因工程的基本原理