【正文】 要有以下幾種生產(chǎn)人胰島素的方法：（一）直接提取法n 這是早期生產(chǎn)人胰島素的方法，直接從人的胰臟中分離純化獲取。該方法由于受原料供應(yīng)的限制，其產(chǎn)量遠遠不能滿足糖尿病人的臨床需求。（二）化學(xué)合成法n 我國生物化學(xué)家花費 8年時間于 20世紀(jì) 60年代中期，在世界上首次人工合成了具有生物活性的結(jié)晶牛胰島素，這項成就開創(chuàng)了世界上人工合成蛋白質(zhì)的新紀(jì)元，成為中國人永遠為之驕傲的輝煌。140 n （三）化學(xué)轉(zhuǎn)型法n 此法是將動物胰島素進行化學(xué)處理，使其轉(zhuǎn)變成人胰島素。如豬的胰島素與人胰島素只在 B鏈的 C末端有一個氨基酸殘基的差異，因此在體外控制合適的反應(yīng)條件，可將豬胰島素酶促轉(zhuǎn)化為人胰島素。該過程的總轉(zhuǎn)化效率為 60% ，但工藝路線耗時，分離純化操作復(fù)雜，因此產(chǎn)品的價格往往較高。n 另外，從動物（豬或牛）的胰臟組織中提取胰島素，雖然原料相對豐富，但也面臨含量低，產(chǎn)量少，價格高等問題。141（四） DNA重組技術(shù)制備法n 上述生產(chǎn)人胰島素方法的種種不利因素，醫(yī)藥公司就嘗試?yán)?DNA重組技術(shù)生產(chǎn)重組人胰島素，n Eli Lilly公司于 1982年成功將重組人胰島素投放市場。通過基因工程方法，把人工合成的編碼胰島素的基因送到大腸桿菌細胞中去，成功構(gòu)建出能生產(chǎn)胰島素的工程菌。大腸桿菌具有操作方便，易于培養(yǎng)，繁殖迅速等優(yōu)點，因此重組人胰島素一經(jīng)問世就顯示出巨大的市場前景，并帶動了其它基因工程藥物的研究與開發(fā)。 142二、重組人胰島素的制備方法n （一） A鏈和 B鏈分別表達法n （二）人胰島素原表達法n （三） A鏈和 B鏈同時表達法n （四）分泌型重組人胰島素表達法143（一） A鏈和 B鏈分別表達法n 1．基因工程菌的構(gòu)建 n ① 用 T4 DNA連接酶，把化學(xué)合成的 A鏈和 B鏈的寡核苷酸片段，連接成 A鏈和 B鏈的全長編碼序列。并分別在 A鏈和 B鏈的 N末端氨基酸之前，添加 Met的密碼子（ ATG），以便在融合蛋白中插入一個 Met殘基，供 CNBr切割之用。n ② 分別將胰島素 A鏈和 B鏈基因插入質(zhì)粒 DNA，并與 β半乳糖苷酶（ βGal）基因融合，構(gòu)建融合表達載體。n ③ 分別將兩個融合表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌細胞中，進行胰島素 A鏈和 B鏈基因的融合表達。經(jīng)過一段時間培養(yǎng)增殖后，分離純化融合蛋白 βGalA和 βGalB。由于受到 βGal的保護作用，胰島素的 A鏈和 B鏈多肽不會被細菌蛋白水解酶所降解。144 n 2．表達產(chǎn)物的后處理 n ① 在體外經(jīng) CNBr處理，胰島素 A鏈和 B鏈從融合蛋白 βGalA和 βGalB中釋放出來。n ② 進一步分離純化胰島素 A鏈和 B鏈多肽。n ③ 將純化的 A鏈和 B鏈多肽融合，經(jīng)半胱氨酸（ Cys）體外氧化和重折疊，形成有活性的胰島素。145 146（二）人胰島素原表達法n 1．基因工程菌的構(gòu)建 ① 采用 RTPCR方法，獲取人胰島素原 cDNA序列。同時在胰島素 B鏈的 N末端氨基酸之前，設(shè)計加入ATG密碼子，供 CNBr從融合蛋白中特異性地將胰島素原前體切割下來。② 將 cDNA序列插入質(zhì)粒載體中，構(gòu)建融合表達載體。③ 用融合表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞，經(jīng)擴增培養(yǎng)后，分離純化含重組人胰島素原的融合蛋白。由于在胰島素原分子中存在 C肽，有利于在 A鏈和 B鏈之間形成正確的二硫鍵。147 n 2．表達產(chǎn)物的后處理 n ① 在 CNBr作用下，通過控制體外切割反應(yīng)，使胰島素原從融合蛋白分子上解離下來。n ② 胰蛋白酶只能從 Arg或 Lys的羧基一側(cè)切割肽鏈，而在 C區(qū)段的末端或其附近有三個 Arg殘基，因此當(dāng)用胰蛋白酶對融合蛋白作短暫處理時，就會在 A鏈和 C肽之間的一個正確位置發(fā)生切割作用，或者在 B鏈羧基末端留下一兩個額外 Arg的切割。n ③ 用羧基肽酶 B將 B鏈羧基末端多余的 Arg切除。148 149 n 3．生產(chǎn)技術(shù)的評價 由于 C肽的存在，胰島素原能形成良好的空間構(gòu)象，三對二硫鍵的正確配對率也相應(yīng)提高，折疊率高達 80%以上。雖然該工藝路線并不比 A、 B鏈分別表達法更為簡捷，而且還需要使用兩種高純度的酶制劑，但理想的折疊率在很大程度上彌補了工藝繁瑣的缺陷，使得每克最終產(chǎn)品的成本比原來降低一半。 目前 Eli Lilly公司采用此工藝年產(chǎn)十幾噸重組人胰島素。150（三） A鏈和 B鏈同時表達法n 本工藝路線與 A鏈和 B鏈分別表達法基本相似，主要區(qū)別在于：前者將化學(xué)合成的 AB鏈編碼序列同時克隆至表達載體，表達融合蛋白 βGalBA；而后者分別將化學(xué)合成的 A鏈和 B鏈編碼序列克隆至載體，分別表達融合蛋白 βGalA和 βGalB。151 n 大體流程如下：先化學(xué)合成 AB鏈的編碼序列，在 B鏈的 N端氨基酸之前，添加 ATG密碼子；與 β半乳糖苷酶基因融合后，將表達載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中；擴增培養(yǎng)后，從中分離純化融合蛋白 βGalBA；體外經(jīng) CNBr處理，將 βGal切除；再經(jīng)蛋白酶特異性裂解，使胰島素 A鏈和 B鏈分離；最后經(jīng)體外氧化折疊，形成有活性的重組胰島素。152（四）分泌型重組人胰島素表達法n 前三種基因工程菌的構(gòu)建均采用胰島素或胰島素原編碼序列與大腸桿菌 β半乳糖苷酶基因拼接的方法，所產(chǎn)生的融合型重組蛋白表達率高、穩(wěn)定性強，但不能分泌，只能以包含體的形式存在于胞質(zhì)中。153 n 一種能促進融合蛋白分泌的工程菌構(gòu)建策略是將胰島素或胰島素原編碼序列與 β內(nèi)酰胺酶基因拼接，此酶通常能被大腸桿菌分泌到胞外。由此獲得的工程菌同時具備了穩(wěn)定高效表達可分泌型融合蛋白的特性，為胰島素的后續(xù)分離純化工序減輕了負(fù)擔(dān)。154（一）疾病相關(guān)基因的分析與克隆根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質(zhì)，而認(rèn)識疾病的分子機制。1. 定位克隆 (positional cloning):它是指從一種致病基因的染色體定位出發(fā)逐步縮小范圍，最后克隆該基因。 2. 功能性克隆 （ fuctional cloning） :它是指從一種致病基因功能的理解出發(fā)克隆該致病基因的方法。第六節(jié) 基因工程與醫(yī)學(xué)的關(guān)系（二）生 物制藥155 重組 DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn) 品 功 能組織胞漿素原激活劑 抗凝血液因子 VIII 促進凝血顆粒細胞 巨噬細胞集落剌激因子 剌激白細胞生成促紅細胞生成素 剌激白細胞生成生長因子 (bFGF, EGF) 刺激細胞生長與分化生長素 治療侏儒癥胰島素 治療糖尿病干擾素 (? 1b, ?2a, ? 2b, ?) 抗病毒感染及某些腫瘤白細胞介素 激活、剌激各類白細胞超氧化物歧化酶 抗組織損傷單克隆抗體 利用其結(jié)合特異性進行診斷試驗、腫瘤導(dǎo)向治療乙肝疫苗 (CHO, 酵母 ) 預(yù)防乙肝目 錄156n 截至 2023年底，中國國家食品藥品管理局（ SFDA）批準(zhǔn)上市的以重組 DNA技術(shù)獲得的生物制品共 480多例，其中 10例為 乙型 肝炎疫苗， 1例為重組人 5型腺病毒， 1例為重組人 P53腺病毒 DNA產(chǎn)品，其它多為細胞因子，激素等，如表皮生長因子。n 血管內(nèi)皮抑制素抗腫瘤藥物 ——“恩度 ” 是我國自主研發(fā)的新藥。157重組藥物的發(fā)展趨勢n 從動物 ,植物和微生物中發(fā)現(xiàn)或找出一批具有藥用價值的蛋白或多肽類 ,并對其進行人工改革造和重組表達 ,這是 開發(fā)創(chuàng)新藥物的一條捷徑 .當(dāng)前 ,許多科學(xué)家看出 豐富海洋資源 的重要意義 .n 通過功能基因組學(xué)的研究 ,發(fā)掘一些新基因 .在這方面 ,因我國人口眾多 ,具有 疾病資源豐富 的優(yōu)勢 ,可從中挖掘出新基因或新蛋白用于基因重組藥物的候選分子 .158 n 采用新的技術(shù)方法 ,發(fā)現(xiàn)一些藥物新的作用機制 ,從中找出新的藥物靶點 ,也可為新藥的源頭創(chuàng)新提供依據(jù) . 目前 ,將功能基因組學(xué) ,生物信息學(xué) ,藥物基因組學(xué) ,蛋白質(zhì)組學(xué) ,RNA干擾及計算機輔助設(shè)計等新技術(shù) ,新方法用于藥物靶點的尋找和篩選 .這是研發(fā)新重組藥物的一個重要途徑 .159 n 對已有治療作用的藥物進行蛋白質(zhì)改造 ,使它成為靶向性更強 ,毒副作用小 ,療效更好的新藥 .同時 ,又可避免藥物知識產(chǎn)權(quán)糾紛 .如 TNFα, 由于其嚴(yán)重的毒性 (如肝毒性和低血壓 )不能作全身用藥 ,通過蛋白質(zhì)工程技術(shù)可對 TNFα 分子中某些氨基酸置換 ,從而得到一些 毒性較低 ,療效更好的 TNFα 分子 .160（三）對基因進行改造 PCR技術(shù)適合進行基因的定點誘變 如通過定點誘變制備長效胰島素 :將人胰島素 B鏈 27位的 Thr改為 Arg, B鏈羧基端氨基化 , A鏈21位的 Asn改為 Gly后 ,可大大延長其半衰期 .161 162基因診斷 (geic diagnosis)是 利用分子生物學(xué)及分子遺傳的技術(shù)和原理，在 DNA水平分析、鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換、缺失或插入等突變。（四）基因診斷基本過程區(qū)分或鑒定 DNA的異常分離、擴增待測的 DNA片斷163MstⅡ 酶切位點 (GCTNAGG)5180。 3180。正常基因5180。 3180。突變基因鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析164+﹣正常人 突變攜帶著 患者鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析165RLFP分析法166分子雜交實驗①②③目 錄167放射自顯影照片目 錄168DNA點陣目 錄169標(biāo)準(zhǔn). 能正確擴增靶基因；. 能準(zhǔn)確區(qū)分單個堿基的差別；. 本底或噪聲低，不干擾 DNA的鑒定 。. 便于完全自動化操作，適合大面積、大人群普查。170（五）基因治療定義基因治療 (gene therapy)是向有功能缺陷的細胞補充相應(yīng)功能的基因，以糾正或補償其基因的缺陷，從而達到治療的目的。方式體細胞基因治療 (somatic cell gene therapy)性細胞基因治療 (germ line gene therapy)1711. 產(chǎn)前診斷2. 攜帶者測試3. 癥候前診斷4. 遺傳病易感性（六）遺傳疾病的預(yù)防172