【正文】 n） 來源不同 的兩條 單鏈 核酸分子通過堿基互補可形成異源雙螺旋。如 DNA/DNA、 DNA/RNA、 RNA/RNA雜交分子。預(yù)雜交（ prehybridization） 概念 ：為了減少探針與廣泛存在的非互補核酸的非特異性結(jié)合，在雜交前用封閉物將這些非特異性位點封閉。這一雜交前的處理過程稱為預(yù)雜交。 常用的封閉物 ：變性的非特異性 DNA，如鮭魚精子 DNA、小牛胸腺 DNA，又稱為覆蓋 DNA。變性、復(fù)性、雜交示意圖核酸探針 ：帶有可檢測標(biāo)記的已知 DNA或 RNA片段，用于檢測待測樣品中的靶核酸序列。探針 分類放射性 標(biāo)記核酸探針非放射性 標(biāo)記核酸探針印跡雜交 概念 ：指將待測核酸序列結(jié)合到一定的支持物上，然后與存在于液相中的核酸探針進(jìn)行雜交的過程。 探針與待測核酸片段中的同源序列形成雜交分子，探針分子顯示的位置及其量的多少可反應(yīng)出待測的核酸分子是否存在相應(yīng)的基因序列及其大小。 分類DNA印跡雜交（ Southern blotting）RNA印跡雜交（ Northern blotting）提取 DNA限制性內(nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳堿變性轉(zhuǎn)移到 NC膜與 DNA或 RNA探針 雜交放射自顯影DNA印跡雜交（ Southern blotting）檢測靶分子為 DNA, 檢測靶分子是否含有目的基因?qū)傊?凝膠 上的 DNA分子轉(zhuǎn)移到 硝酸纖維素膜 上? 菌落原位雜交（ In situ hybridization）含有與探針互補序列的菌落或噬菌斑經(jīng)放射自顯影后，在 X光底片上出現(xiàn)雜交點。將轉(zhuǎn)化后得到的菌落或噬菌斑原位轉(zhuǎn)移到 NC膜上，得到一個與平板菌落或噬菌斑分布完全一致的復(fù)制品。原位裂解細(xì)胞，堿變性，核酸分子被固定于膜上加入標(biāo)記的 DNA或 RNA探針進(jìn)行 雜交根據(jù)陽性反應(yīng)位置，可從保留的母板上挑出所需的 陽性克隆 。RNA印跡雜交（ Northern blotting） 檢測靶分子為 RNA。主要用于檢測某一組織或細(xì)胞中已知的特異 mRNA的表達(dá)水平，或比較不同組織或細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。 與 Southern blotting不同的是在轉(zhuǎn)移前不需進(jìn)行限制性內(nèi)切酶切割。 核酸雜交分類表核酸雜交分類表雜交方法 適 用 范 圍Southern 印跡 檢測經(jīng)凝膠電泳分開的 DNA分子，需轉(zhuǎn)印到膜上Northern 印跡 檢測經(jīng)凝膠電泳分開的 RNA分子，需轉(zhuǎn)印到膜上斑點雜交 檢測未經(jīng)分離的、固定在膜上的 DNA或 RNA分子菌落或噬菌斑雜交 檢測固定在膜上的、經(jīng)裂解后從細(xì)菌或噬菌體中釋放出的 DNA分子原位雜交 檢測細(xì)胞或組織中的 DNA或 RNA分子免疫學(xué)方法 免疫學(xué)篩選是利用特異 抗體 與目的基因表達(dá)的 抗原 產(chǎn)物相互作用進(jìn)行篩選，特異性和敏感性也較高，尤其適用于篩選不為宿主菌提供任何選擇標(biāo)記的基因，或者是已獲得了該基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的多克隆或單克隆抗體，用這些抗體來檢測目的基因表達(dá)的產(chǎn)物。免疫學(xué)方法很多，如 Western blot，免疫化學(xué)方法、酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）、放射免疫沉淀、免疫熒光抗體技術(shù)等，可 對目的基因表達(dá)的蛋白進(jìn)行定性，甚至定量檢測 。 基因工程的最終目的是在一個 合適的系統(tǒng) 中，使 外源基因高效表達(dá) ，從而產(chǎn)生有重要價值的 蛋白質(zhì) 產(chǎn)品。 其過程包括外源基因克隆，外源基因在宿主細(xì)胞中經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工等過程表達(dá)相應(yīng)蛋白以及蛋白產(chǎn)物的分離純化等過程。 （六）克隆基因的表達(dá)目前世界范圍內(nèi)開發(fā)的基因工程多肽藥物、疫苗、抗體有500多種 原核表達(dá)體系 ，運用 有用的蛋白質(zhì)必須使構(gòu)建的 表達(dá)載體 符合下列標(biāo)準(zhǔn)： ① 含大腸桿菌適宜的 選擇標(biāo)志 ② 具有能調(diào)控轉(zhuǎn)錄、產(chǎn)生大量 mRNA的 強啟動子 ③ 含適當(dāng)?shù)?翻譯控制序列 ④ 含有合理設(shè)計的 多克隆位點 ，以確保目的基因按一定 方向與載體正確連接。外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá) 不足之處 ：① 缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機制 ， 的 cDNA， 不宜表達(dá)真核基因組 DNA ② 缺乏適當(dāng)?shù)姆g后加工機制 ， 蛋白質(zhì)不能形成適當(dāng)?shù)恼郫B或進(jìn)行糖基化修飾③ 表達(dá)的蛋白質(zhì)常常形成 不溶性的包涵體④ 很 難 在 表達(dá)大量的可溶性蛋白質(zhì)外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá) 目前常用的 真核表達(dá)體系 有酵母、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系。 利用真核細(xì)胞作為基因的表達(dá)體系已被證明具有許多原核表達(dá)體系所不具備的優(yōu)勢 ① 不僅可以表達(dá)克隆的 cDNA ,也可表達(dá)真核 基因組 DNA ② 識別和去除內(nèi)含子 , 經(jīng) 剪接加工 形成成熟的 mRNA ③ 對蛋白進(jìn)行 翻譯后加工 ,最大限度地保證蛋白質(zhì)的 生物學(xué)活性 三、 DNA重組技術(shù)對醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)發(fā)展的貢獻(xiàn)? 對人類遺傳信息的認(rèn)識? 基因工程藥物與疫苗? 轉(zhuǎn)基因動物和植物? 基因診斷與基因治療鐮刀型紅細(xì)胞貧血 Chehab等設(shè)計一對引物把含有突變的 DNA片段（共 294bp）擴增，擴增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶 OxaN I消化，瓊脂糖凝膠電泳后染色觀察： 正常人有 2個片段， 191 和 103bp， 鐮刀狀紅細(xì)胞貧血的 純合子 ，僅有一個片段 294bp 雜合子 有 19 103和 294bp 3個片段 思考題一、基本概念 DNA重組技術(shù) 限制性核酸內(nèi)切酶 回文結(jié)構(gòu) 目的基因 基因組 DNA文庫 cDNA文庫 α互補二、簡述題，簡述其基本過程。，有哪些來源？3. 解釋基因載體，哪些 DNA 可作為基因載體？、缺點。 演講完畢，謝謝觀看！