【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 體衍生載體可分兩類 : 一類是 插入型載體 ，即外源基因插入到載體上單一的限制酶位點(diǎn)，如 λgt系列等。 另一類是 置換型 ，即兩個(gè)限制酶位點(diǎn)之間的 DNA片段可被外源 DNA取代，如 Charon， EMBL系列等。? M13噬菌體載體 M13噬菌體基因組是 單鏈環(huán)狀 DNA，當(dāng)它侵犯宿主菌后，在細(xì)菌胞內(nèi)酶的作用下，單鏈 DNA轉(zhuǎn)變成復(fù)制型雙鏈DNA，可提取出來做基因重組。 經(jīng)改造的 M13噬菌體有 M13 mp系列和 pUC系列。? M13噬菌體載體 —pUC19α互補(bǔ) ：?jiǎn)为?dú)存在的 α及 ω片段都沒有半乳糖苷酶的活性，只有宿主細(xì)胞與克隆載體同時(shí)表達(dá)兩個(gè)片段時(shí)，宿主細(xì)胞內(nèi)才有 半乳糖苷酶活性，使特異性作用物（ Xgal）變?yōu)?藍(lán)色化合物 。突變型 lac 表達(dá) β半乳糖苷酶的 ω 片段 。如果插入的外源基因是在 lacZ’基因內(nèi)，就會(huì)影響 lacZ’的表達(dá)，利用 lac 胞，在含 Xgal的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)會(huì)出現(xiàn) 白色菌落 ；若無外源基因插入，則出現(xiàn) 藍(lán)色菌落 。多克隆位點(diǎn)編碼 β半乳糖苷酶的 α片段病毒載體 是一類 真核載體 ，能把基因引入到 真核細(xì)胞中，并在其中被表達(dá)。因此是研究真核細(xì)胞表達(dá)及調(diào)控的有力工具。如 :腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乳頭瘤病毒等。二、重組 DNA技術(shù)基本原理? 目的基因 的獲取? 克隆 載體 的選擇和構(gòu)建? 外源基因與載體的 連接? 重組 DNA導(dǎo)入受體菌? 重組體的 篩選? 克隆基因的 表達(dá)（一）目的基因的獲取? 化學(xué)合成法? 基因組 DNA? cDNA? 聚合酶鏈反應(yīng)1. 化學(xué)合成法 已知某種基因的核苷酸序列，或根據(jù)某種基因產(chǎn)物的氨基酸序列推導(dǎo)出編碼該多肽鏈的核苷酸序列，再利用 DNA合成儀 通過化學(xué)合成原理合成目的基因。 利用該法合成的基因有：人生長(zhǎng)激素釋放抑制因子、 胰島素原、 腦啡肽、干擾素基因等2. 基因組 DNA 利用 限制性核酸內(nèi)切酶 將染色體 DNA切割成一定基因水平的許多片段，將這些片段與適當(dāng)?shù)目寺≥d體拼接成重組 DNA分子，繼而 轉(zhuǎn)入受體菌 擴(kuò)增，使每個(gè)細(xì)菌內(nèi)都攜帶 一種 重組 DNA分子的多個(gè)拷貝。 不同細(xì)菌所包含的重組 DNA分子可能為不同的染色體 DNA片段，這樣全部轉(zhuǎn)化細(xì)菌所攜帶的各種染色體片段就代表了染色體的整個(gè)基因組。存在于轉(zhuǎn)化細(xì)菌內(nèi)、由克隆載體所攜帶的所有 基因組 DNA片段的集合 稱為 基因組 DNA文庫 （ genomic DNA library）?；蚪M DNA文庫涵蓋了基因組全部的遺傳信息。 建立基因組文庫后，需結(jié)合適當(dāng) 篩選方法 從眾多轉(zhuǎn)化子菌落中選出含有某一基因的菌落，再進(jìn)行 擴(kuò)增 ，將重組 DNA分離、回收，以獲得目的基因。3. cDNA 把細(xì)胞 總 mRNA通過逆轉(zhuǎn)錄合成 總 cDNA，再與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，從而得到含有某種生物體全部cDNA集合（稱為 cDNA 文庫 ， cDNA library）。然后用適當(dāng)?shù)姆椒◤?cDNA文庫中 篩選 出目的 cDNA。 cDNA文庫 的特點(diǎn)是它只包括已經(jīng) 被轉(zhuǎn)錄 成 mRNA的那些 基因序列 ，且 不包括內(nèi)含子及調(diào)控序列 ，所以cDNA文庫的復(fù)雜性要比基因組文庫低的多。 但由于不同的細(xì)胞類型、發(fā)育階段以及細(xì)胞所處的特定狀態(tài)是由特定基因的表達(dá)所決定的，因此各自的mRNA種類就不同，由此產(chǎn)生的 cDNA又是獨(dú)特的。與基因組 DNA文庫類似，由 總 mRNA制作的 cDNA文庫包含了細(xì)胞表達(dá)的各種 mRNA信息，自然也含有我們感興趣的編碼 cDNA。4. 聚合酶鏈反應(yīng)（ polymerase chain reaction,PCR） 參見 437頁Chain ReactionPolymerase chain reactionPCR的產(chǎn)物數(shù)目的產(chǎn)物數(shù)目以指數(shù)級(jí)方式增長(zhǎng)以指數(shù)級(jí)方式增長(zhǎng)中子的釋放數(shù)目中子的釋放數(shù)目以指數(shù)級(jí)方式增長(zhǎng)以指數(shù)級(jí)方式增長(zhǎng)中子中子原子核原子核 短時(shí)間內(nèi)巨大的短時(shí)間內(nèi)巨大的能量釋放，能量釋放，原子爆炸原子爆炸DNA片段片段Cycle 1Cycle 2Cycle 3Cycle N理論上可達(dá)理論上可達(dá) 2n個(gè)拷貝個(gè)拷貝原料原料 （（ pg）） 產(chǎn)物產(chǎn)物 (ug)PCR 的基本原理? 體外 高效、快速、特異 地?cái)U(kuò)增目的基因或 DNA片段的 技術(shù) 。? 其原理類似于 DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給 DNA的體外合成提供一種合適條件 —— 模板 DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖液系統(tǒng)和 DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間等，使 目的 DNA得以迅速擴(kuò)增 DNA的體內(nèi)復(fù)制：原料： 模板 DNA（ 基因組 DNA），隨機(jī)小分子 RNA引物， dNTPs酶： DNA聚合酶，解旋酶，引發(fā)酶反應(yīng)條件： 胞液環(huán)境， 37 ℃ 反應(yīng)過程： 模板 DNA解旋、引發(fā)體的形成、延長(zhǎng) （三階段）產(chǎn)物： 模板 DNA （ 基因組 DNA）拷貝數(shù)增加 一倍 原料： 模板 DNA（ 基因組 DNA ， cDNA）一對(duì) 特異性 寡核苷酸引物， dNTPs酶： Taq DNA聚合酶反應(yīng)條件： 合適的緩沖液，三種 變化的溫度 （ 94， 5070， 72 ℃ ），一定的 循環(huán)數(shù) （ 2535）l反應(yīng)過程： DNA模板變性（解鏈）、 模板與引物退火 、引物延伸 （三階段，多循環(huán) ）l產(chǎn)物： 目的 DNA（特異性）拷貝數(shù)增加 2n倍PCR：DNA模板變性? 與體內(nèi) DNA解鏈過程不同， PCR中作為模板的 雙鏈 DNA是通過95℃ 左右的 高溫 使其發(fā)生變性，形成 單鏈 DNA 模板與引物退火? PCR通常需要兩條 寡核苷酸鏈 作為 DNA合成時(shí)的 引物 （primer） ,這兩個(gè)引物分別與待擴(kuò)增模板 DNA的 目標(biāo)片段 兩端的序列互補(bǔ)。在降低溫度的過程中，通過控制 退火條件，引物就能準(zhǔn)確地與擴(kuò)增區(qū)域的兩端配對(duì)。primers? ⑴ 引物 短 ，不易纏繞；? ⑵ 設(shè)計(jì)的引物是與模板 DNA兩端序列互補(bǔ)；? ⑶ 引物的量 遠(yuǎn)大于 模板分子的量，引物與模板 DNA形成雙鏈的幾率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 DNA分子自身的復(fù)性。 引物延伸? 在 PCR反應(yīng)體系中的 DNA聚合酶 ，能夠催化反應(yīng)體系中游離的單核苷酸（ dNTPs）由引物 539。→339。 方向，按堿基配對(duì)的原則延伸，形成兩條與模板 DNA互補(bǔ)的復(fù)制鏈。Taq 酶 dNTPSl 新合成