【文章內(nèi)容簡介】 片段兩端帶有對稱的多克隆位點 。 四、單鏈?zhǔn)删w載體 1． M13 噬菌體的生物學(xué) M13 噬菌體顆粒是絲狀的，只感染革蘭氏陽性大腸桿菌。感染宿主后不裂解宿主細(xì)胞，而是從感染的細(xì)胞中分泌出噬菌體顆粒，宿主細(xì)胞仍能繼續(xù)生長和分裂。 M13 噬菌體的基因組為單鏈 DNA （ +DNA），由 6407 的堿基組成。基因組 90% 以上的序列可編碼蛋白質(zhì)，共有 11 個編碼基因，基因之間的間隔區(qū)多為幾個堿基。較大的間隔位于基因 Ⅷ 和基因 Ⅲ 以及基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之間，其間有調(diào)節(jié)基因表達和 DNA 合成的元件。 M13 噬菌體基因組可編碼 3 類蛋白質(zhì)，包括復(fù)制蛋白，形態(tài)發(fā)生蛋白，結(jié)構(gòu)蛋白。 M13沒有包裝限制： 單鏈?zhǔn)删w的特點： （ 1）存在兩種類型， ssDNA和 RF dsDNA； （ 2） +DNA（ ssDNA）； （ 3）復(fù)制型（ RF）是雙鏈環(huán)狀 DNA； （ 4） RF dsDNA和 ssDNA都能轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌，并產(chǎn)生噬菌斑； （ 5）不存在包裝限制； （ 6）可產(chǎn)生大量的含有外源 DNA插入片斷的單鏈分子，便于作探針或測序。 J. Messing證明，IG區(qū)存在 M13的復(fù)制起點，可以插入外源DNA而不影響M13噬菌體的活力。 M13的生活周期 雄性細(xì)菌的 F性菌毛 ： 僅見于少數(shù)革蘭陰性菌，比普通菌毛略微稍粗，一個菌體只有 1～ 4根，通常由質(zhì)粒編碼。帶有性菌毛的細(xì)菌具有致育能力，稱為 F+菌或者雄性菌。雄性菌的遺傳物質(zhì)能通過性菌毛傳遞給 F菌，這個過程稱為接合。細(xì)菌可以通過這個方式傳遞耐藥性以及毒力。此外，性菌毛還是某些噬菌體感染宿主菌的受體。 3. M13載體的構(gòu)建 單鏈 DNA 的酶切和連接是比較困難的，因此 M13 噬菌體在用作載體時是利用其雙鏈 RF DNA。 RF DNA 很容易從感染細(xì)胞中純化出來，可以象質(zhì)粒一樣進行操作，并可通過轉(zhuǎn)化方法再次導(dǎo)入細(xì)胞。 1）載體的插入位點 在 M13 噬菌體基因組中絕大多數(shù)為必需基因，只有兩個間隔區(qū)可用來插入外源 DNA?；? Ⅱ 和基因 Ⅳ 之間的 508bp 間隔區(qū)是主要的外源片段插入位點。在基因 Ⅷ 和基因 Ⅲ 之間的小間隔區(qū)也可用來插入外源片段，但是在操作過程中，需要獲得感染細(xì)胞的菌落進行影印篩選，比利用可見的噬菌斑方法更慢更麻煩。 2） M13 噬菌體載體組成 現(xiàn)在所使用的 M13 噬菌體載體是 Messing 及其同事建立的 mp 系列載體，以基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之間的區(qū)域作為外源 DNA 插入?yún)^(qū)。 mp 載體系列都是從同一個重組 M13 噬菌體 （ M13mpl） 改造而來的。在 M13mpl 載體中，間隔區(qū)內(nèi)的 HaeⅢ 位點插入了一小段大腸桿菌 DNA ，引入laz的 α 互補篩選。 3） M13載體系列 ① M13載體系列的命名： M13mpn， n代表系列數(shù)字。 ② 對 M13mp1的改進：加上常用的酶切位點。如 B. Gronenborn和 J. Messing1978年把 LacZ’ 5’端的第 13個核苷酸 G突變成 A，產(chǎn)生了一個 EcoR I切點，構(gòu)建成 M13mp2。 ③ 對 M13mp2的進一步改進產(chǎn)生了 M13mp系列載體。在 M13mp2的 LacZ’的 5‘端加上一段人工合成的多克隆位點（ MCS）。如 M13mp M13mpM13mp M13mp M13mp1 M13mp1 M13mp19。 4） M13mpl8 和 M13mpl9 M13mpl8 和 M13mpl9 這兩個載體含有 13 個不同的酶切位點，可供插入由多種各不相同的限制酶切割而成的 DNA 片段。 M13mpl8 和 M13mpl9 DNA 的全序列已經(jīng)測定完成，這兩種載體只是在 lacZ 區(qū)內(nèi)不對稱的多克隆區(qū)的方向上有所不同。 M13mpl8 和 M13mpl9 輕易不能重新環(huán)化。僅當(dāng)連接混合液中含有帶匹配末端的外源雙鏈 DNA片段時，方可閉合成環(huán)。這一片段在 M13mpl8 和 M13mpl9 中將以兩個互為相反的方向插入。這樣一來，在 M13mpl8 重組體的子代噬菌體內(nèi)含有外源 DNA 的一條鏈， M13mpl9 重組體的子代噬菌體內(nèi)則含有它的互補鏈。故用 M13mpl8 和 M13mpl9 作為一對載體，就可能用一個引物 ，從所插入 DNA 片段的任一端開始，測定互為相反的兩條鏈的 DNA 序列，并可制備只與外源 DNA 的任意一條鏈互補的 DNA 探針。 M13mp1 M13 RF BsuI不完全消化 各種長度的線性片斷 （其中應(yīng)有只在 IG上切開的線性全長 M13） lac基因的 HindII片斷 (lacI、 lacP、lacO、 lacZ’） JM101宿主 只有在 IG區(qū)插入 lacZ’才能存活并在 Xgal上出現(xiàn)互補的藍(lán)噬菌斑 4. M13系列載體的優(yōu)點： （ 1）有 MCS，便于克隆不同的酶切片段。 （ 2） Xgal顯色反應(yīng)，可供直接選擇。 （ 3）無包裝限制，克隆能力大。 （ 4）可以克隆雙鏈 DNA分子中的每一條鏈（子代 M13噬菌體中包含的是單連+DNA）。 5. M13載體的缺點： （ 1） 插入外源 DNA后，遺傳穩(wěn)定性顯著下降。 （ 2）實際克隆能力小于 1500bp（雖無包裝限制，并非無限包裝）。 五、 COS質(zhì)粒載體 cosmid 是英文 cos sitecarrying plasmid 的縮寫 , 也稱粘粒、柯斯載體。本意是帶有粘性末端位點的質(zhì)粒 , 因此 , 柯斯質(zhì)粒是人工建造的的含有 λDNA的 cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。 1. 結(jié)構(gòu)特點 ： 在普通質(zhì)粒載體中插入一個或兩個來自 λ的 cos位點片段，雙 cos載體比單 cos載體易于重組， cos結(jié)構(gòu)長 200 bp，由以下幾個亞單位組成： a. cosN— λ末端酶的 gpA亞基識別和切割，產(chǎn)生 512 nt突起； b. cosB— 分別位于 cosN的兩側(cè)，稱之為 cosBL（左側(cè)）和 cosBR（右側(cè)），為 λ末端酶的結(jié)合位點。 C o s B C o s N R 3 I1 R 2 R 1 N u 1 + 2 0 0 8 0優(yōu)點： 容量大（可達 45 kb），用于基因簇的克?。? 形成的重組 DNA分子可進行體外包裝，并能感染 （在細(xì)胞內(nèi)不能形成噬菌體顆粒，因而不能形成噬菌斑）； 操作簡便，可直接轉(zhuǎn)化細(xì)胞； 對重組 DNA分子長度具有選擇性包裝； 遺傳標(biāo)記：與質(zhì)粒載體相同，利用抗生素抗性選擇轉(zhuǎn)化子，例子 : pJB8和 C2XB 六、噬菌粒載體（ phagemid vectors） 噬菌粒（ phagemid）實際上是帶有絲狀噬菌體大間隔區(qū)的質(zhì)粒載體，是集質(zhì)粒和絲狀噬菌體的有利特征于一身的載體，具有 ColE1 復(fù)制起點及抗生素抗性選擇標(biāo)記的質(zhì)粒，以及絲狀體噬菌體的間隔區(qū)。此間隔區(qū)含噬菌體 DNA 合成的起始與終止及噬菌體顆粒形態(tài)發(fā)生所必需的全部順式作用序列。含噬菌粒的細(xì)菌被噬菌體感染后，基因 Ⅱ 蛋白可作用于噬菌粒的間隔區(qū)，啟動滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)生 ssDNA 并進行包裝。 噬菌粒具有以下特征： ① 雙鏈 DNA 既穩(wěn)定，又高產(chǎn)，具有常規(guī)質(zhì)粒的特征； ② 免卻了將外源 DNA 片段從質(zhì)粒亞克隆于噬菌體載體這一既繁瑣又費時的步驟； ③ 由于載體足夠小，故可得到長達 10kb 的外源 DNA 區(qū)段的單鏈； ④兩種復(fù)制形式：既具有質(zhì)粒的復(fù)制起點，又具有噬菌體的復(fù)制起點。因此，既能在大腸桿菌中以質(zhì)粒的形式雙鏈復(fù)制，又能在噬菌體內(nèi)進行單鏈復(fù)制。 噬菌粒的主要優(yōu)點在于它 可以產(chǎn)生大段外源 DNA 的適量單鏈拷貝，又不必?fù)?dān)心發(fā)生缺失突變，而這些外源 DNA 區(qū)段常常由于太大而不能克隆于常規(guī) M13 載體 。但許多噬菌粒都有一個主要缺點，即輔助噬菌體感染后，有時候單鏈 DNA 的產(chǎn)量較低且重復(fù)性較差。 第三節(jié) 人工染色體載體 酵母人工染色體 （ yeast artificial chromosome, YAC)： YAC人工染色體載體是利用釀酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）的染色體的復(fù)制元件構(gòu)建的載體，其工作環(huán)境也是在釀酒酵母中。 1983年形成 YAC構(gòu)建理論 , 1987年變?yōu)楝F(xiàn)實。釀酒酵母的形態(tài)為扁圓形和卵形，生長的代時為 90 分鐘；含 16 條染色體，每條的大小為 2251900kb；具真核 mRNA 的加工活性。 （ 1） DNA復(fù)制起始點（ ori） （ 2）著絲粒（ centromere， cen） （ 3）兩個端粒（ telomeres， tel） 染色體復(fù)制和遺傳的三個基本組件： TEL TEL CEN ORI （ 1）著絲粒區(qū)（ CEN） A A GTCACGTG T TGTTTCTGNTTTCCGAAA 酵母染色體著絲粒區(qū)的保守序列 : I II III 7886bp 酵母第 11號染色體的著絲粒區(qū)序列 YAC的組成結(jié)構(gòu) （ 2）端粒（ TEL） 兩個端粒 保守序列 是 (G4T2)n 重復(fù)序列。如 人是 TTAGGG重復(fù)序列 。 四膜蟲是 GGGTTG重復(fù)序列。 （ 3）復(fù)制起點（ ORI） 約 100bp的自主復(fù)制序列（ ARS）。 （ 4）克隆位點 克隆位點位于 SUP4 基因內(nèi)部。插入外源基因?qū)е?SUP4酶失活，酵母菌落呈 紅色； 不失活的菌落是白色。 （ 5）在酵母中的標(biāo)記基因 TRP1（色氨酸缺陷）、 URA3（尿嘧啶缺陷）， 分別位于兩臂。 （ 6）在細(xì)菌中操作 細(xì)菌的復(fù)制起點 ori和抗生素標(biāo)記 Ampr （一） YAC人工染色體載體的復(fù)制元件 （ 1）兩個端粒重復(fù)序列（ telomeric repeat， TEL）：定位于染色體末端一段序列，用于保護線狀的 DNA 不被胞內(nèi)的核酸酶降解，以形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。 （ 2）著絲粒（ centromere， CEN）：有絲分裂過程中紡錘絲的結(jié)合位點，使染色體在分裂過程中能正確分配到子細(xì)胞中。在 YAC 中起到保證一個細(xì)胞內(nèi)只有一個人工染色體的作用。如 pYAC4 使用的是酵母第四條染色體的著絲粒。 （ 3）自主復(fù)制序列（ autonomously replication sequences， ARS） 一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 進行雙向復(fù)制所必須的信號。 （二） YAC的特點 （ 1）只能在酵母細(xì)胞中擴增。 （ 2）克隆容量大，為 230kb1700kb。 （ 3）構(gòu)建原理是按染色體結(jié)構(gòu)構(gòu)建。 （三） YAC的組成結(jié)構(gòu) （ 1）著絲粒區(qū)（ CEN）：酵母染色體著絲粒區(qū)的保守序列由三個區(qū)組成。 （ 2）端粒（ TEL）：兩個端粒序列 Tel。酵母端粒保守序列是 (G4T2)n 重復(fù)序列。（人是TTAGGG重復(fù)序列 。 四膜蟲是 GGGTTG重復(fù)序列） （ 3）自主復(fù)制序列（ ARS）： 約 100bp的自主復(fù)制序列（ ARS）。（真核生物中只有酵母菌有 ARS） （ 4）克隆位點：位于 SUP4 基因內(nèi)部。 （ 5）選擇標(biāo)記： YAC 載體的選擇標(biāo)記主要采用營養(yǎng)缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和組氨酸合成缺陷型基因 trp leu 2和 his 尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等，以及赭石突變抑制基因 sup4 。與 YAC 載體配套工作的宿主酵母菌（如 AB1380）的胸腺嘧啶合成基因帶有一個赭石突變 ade 21。帶有這個突變的酵母菌在基本培養(yǎng)基上形成紅色菌落，當(dāng)帶有赭石突變抑制基因 sup4 的載體存在于細(xì)胞中時，可抑制 ade 21基因的突變效應(yīng)，形成正常的白色菌落。利用這一菌落顏色轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象，可用于篩選載體中含有外源 DNA 片段插入的重組子。 （ 6）在細(xì)菌中操作：細(xì)菌的復(fù)制起點 ori和抗生素標(biāo)記 Amp r 。 （三） YAC的組成結(jié)構(gòu) （ 1）著絲粒區(qū)（ CEN）：酵母染色體著絲粒區(qū)的保守序列由三個區(qū)組成。 （ 2）端粒（ TEL）：兩個端粒序列 Tel。酵母端粒保守序列是 (G4T2)n 重復(fù)序列。（人是TTAGGG重復(fù)序列 。 四膜蟲是 GGGTTG重復(fù)序列） （ 3）自主復(fù)制序列（ ARS）： 約 100bp的自主復(fù)制序列（ ARS）。（真核生物中只有酵母菌有 ARS） （ 4）克隆位點：位于 SUP4 基因內(nèi)部。 （ 5）選擇標(biāo)記： YAC 載體的選擇標(biāo)記主要采用營養(yǎng)缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和組氨酸合成缺陷型基因 trp leu 2和 his 尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等，以及赭石突變抑制基因 sup4 。與 YAC 載體配套工作的宿主酵母菌（如 AB1380）的胸腺嘧啶合成基因帶有一個赭石突變 ade 21。帶有這個突變的酵母菌在基本培養(yǎng)基上形成紅色菌落，當(dāng)帶