基因重組和基因工程(編輯修改稿)
2025-01-25 17:02 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 A第二鏈合成，雙鏈 DNA 3?末端標記等 反轉錄酶 ① 合成 cDNA ② 替代 DNA聚合酶 I進行填補，標記或 DNA序列分析 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸 5180。羥基末端磷酸化，或標記探針 末端轉移酶 在 3180。羥基末端進行同質多聚物加尾 堿性磷酸酶 切除末端磷酸基 目錄 限制性核酸內(nèi)切酶 (restriction endonuclease) 限制性核酸內(nèi)切酶 (restriction endonuclease, RE)是識別 DNA的特異序列 , 并在識別位點或其周圍切割雙鏈 DNA的一類內(nèi)切酶 。 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam HⅠ ? 定義： 目錄 與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統(tǒng) ， 限制外源 DNA， 保護自身 DNA。 Ⅰ 、 Ⅱ 、 Ⅲ （基因工程技術中常用 Ⅱ 型） ? 分類： ? 作用： 目錄 第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名 ， 用大寫； 第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫； 第四個字母代表株； 用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。 ? 命名： Hin dⅢ 屬 系 株 序 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血桿菌 d株的第三種酶 目錄 Ⅱ 類酶識別序列特點 —— 回文結構 (palindrome) 切口 ： 平端切口 、 粘端切口 GGATCC CCTAGG 目錄 Bam HⅠ GTC CAG G CCTAG GATCC G + GGATCC CCTAGG HindⅡ GTCGAC CAGCTG GAC CTG + 平端切口 粘端切口 目錄 來源不同的限制酶 ， 但能識別和切割同一位點 ， 這些酶稱 同功異源酶 。 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + BstⅠ ?同功異源酶： 目錄 有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同 ， 但切割 DNA后 ， 產(chǎn)生相同的粘性末端 ，稱為同尾酶 。 這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端 (patible end)。 Bam HⅠ Bg lⅡ GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGA G CCTAG GATCC G + + A TCTAG GATCT A ? 同尾酶 目錄 名 稱 識別序列及切割位點 名 稱 識別序列及切割點 切割后產(chǎn)生５ ’突出末端 : BamHⅠ 5’…G ▼GATCC...3’ Bgl Ⅱ 5’…A ▼GATCT...3’ EcoR Ⅰ 5’…G ▼AATTC...3’ Hind Ⅲ 5’…A ▼AGCTT...3’ Hpa Ⅱ 5’…C ▼CGG...3’ Mbo Ⅰ 5’… ▼GATC...3’ Nde Ⅰ 5’…GA ▼TATG...3’ 切割后產(chǎn)生 3’突出末端 : Apa Ⅰ 5’…GGGCC ▼C...3’ Hae Ⅱ 5’…PuGCGC ▼Py...3’ Kpn Ⅰ 5’…GGTAC ▼C...3’ Pst Ⅰ 5’…CTGCA ▼G...3’ Sph Ⅰ 5’…GCATG ▼C...3’ 切割后產(chǎn)生平末端 : Alu Ⅰ 5’…AG ▼CT...3’ EcoR Ⅴ 5’…GAT ▼ATC...3’ Hae Ⅲ 5’…GG ▼CC...3’ Pvu Ⅱ 5’…CAG ▼CTG...3’ Sma Ⅰ 5’…CCC ▼GGG...3’ 限制性內(nèi)切核酸酶 目錄 （三）目的基因 (target gene) ? cDNA (plementary DNA) 指經(jīng)反轉錄合成的、與 RNA (通常指mRNA或病毒 RNA)互補的單鏈 DNA。以單鏈 cDNA為模板、經(jīng)聚合反應可合成雙鏈 cDNA。 ? 基因組 DNA (genomic DNA) 指代表一個細胞或生物體整套遺傳信息(染色體及線粒體 )的所有 DNA序列。 目錄 （四）基因載體 ? 定義 為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質所采用的一些 DNA分子。 ? 常用載體 質粒 DNA 噬菌體 DNA 病毒 DNA 目錄 ?克隆載體 (cloning vector) 為使插入的外源 DNA序列被擴增而特意設計的載體稱為 克隆載體 。 ?表達載體 (expression vector) 為使插入的外源 DNA序列可轉錄翻譯成 多肽鏈而特意設計的載體稱為 表達載體 。 目錄 ? 載體的選擇標準： ?能自主復制； ?具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定； ?有克隆位點（外源 DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點； ?分子量小，以容納較大的外源 DNA。 目錄 (plasmid) 特點 : 能在宿主細胞內(nèi)獨立自主復制；帶有某些遺傳信息 , 會賦予宿主細胞一些遺傳性狀 。 目錄 目錄 目錄 ? λ噬菌體 DNA改造系統(tǒng) λgt系列（插入型，適用 cDNA克?。? EMBL系列（置換型，適用基因組克?。? (phage) ? M13噬菌體 DNA改造系統(tǒng)（含 lacZ基因） M13mp系列 pUC系列 目錄 3. 粘性質粒 (cosmid) 目錄 ? 酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC) ? 細菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC) ? 動
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