高中生物基因重組與基因工程大學(編輯修改稿)
2025-02-04 13:36 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 4多聚核苷酸激酶 催化核酸 539。羥基磷酸化 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 催化 339。端合成同聚尾 第二節(jié) 基因克隆常用的載體 載體 (vector) 是指能在連接酶作用下和外源 DNA片段連接起來，并運送到宿主細胞的運載工具。 其化學本質(zhì)為 DNA分子 。 本節(jié)主要內(nèi)容 載體必須具備的基本條件 載體的分類 常用的載體 一、載體必須具備的基本條件 ⒈ 具有獨立復制能力 ⒉ 具備多個限制酶的識別位點 (多克隆位點 ) ⒊ 具有 遺傳表型或 篩選 標記 ⒋ 有 足夠的容量 以容納外源 DNA片段 ⒌ 可導入受體細胞。 二、載體的分類 * （一） 克隆載體 用來克隆和擴增 DNA片段的載體。 有質(zhì)粒 DNA、噬菌體 DNA和病毒 DNA三類 。 （二） 表達型載體 為了使插入的外源 DNA能夠表達為多肽鏈而設計的載體稱為 表達型載體 。 表達型載體 除需載體必備條件外，還需相應的 啟動子、核糖體結合位點、增強子、終止子 等表達調(diào)控構件。 三、常用的載體 （一） 質(zhì)粒 (plasmid)： 是存在于細菌染色體外的、能自主復制的雙鏈環(huán)狀 DNA分子。 作為克隆載體的質(zhì)粒應具備以下特點： 1. 分子量相對較小，能穩(wěn)定存在于細菌體內(nèi)， 有較高的拷貝數(shù)； 2. 具有 1個以上的遺傳標志，便于篩選； 3. 具有多克隆位點。 總而言之，質(zhì)粒載體應該是一種分子量較小、高拷貝的“松弛型”質(zhì)粒，且具有一個以上遺傳標志和多克隆位點的質(zhì)粒。 廣泛應用的質(zhì)粒： pBR32質(zhì)粒、 pUC系列等 pBR322質(zhì)粒 ① 4363 bp ② 含一個復制點 ③ 含一個抗氨卞青霉素基因(ampR) ④ 一個抗四環(huán)素基因 (tetR) ⑤ ampR和 tetR抗性基因內(nèi)各有一些限制酶的酶切位點，供外源基因插入 當外源基因插入抗藥基因內(nèi)后，抗藥基因失活。AmpR→Amp 敏感 (AmpS )、TetR→Tet 敏感 (TetS). pUC系列質(zhì)粒 由 pBR322和 M13噬菌體構建而成的雙鏈質(zhì)粒載體； （ 1） 2674bp； （ 2） 有 ampR和與 M13噬菌體 相同的多克隆位點 （ MCS） （ 3） 有 1個來自 LacZ基因 片斷 , 編碼半乳糖苷酶 ，便于藍白篩選 (二 )λ 噬菌體 組成特點 ： 雙鏈線狀 DNA分子， 全長 50kb， 含 66個基因， 在其分子兩端各含有12個堿基的互補單鏈，是天然的粘性末端，被稱為COS位點 。 λ噬菌體兩種生長途徑（示意圖） λ 噬菌體感染細菌后的 兩種生長途徑 溶菌性生長 噬菌體感染細菌后 ， 借助其 2個 COS位點互補 成環(huán) ， 在宿主菌體內(nèi) 連續(xù)復制 ， 合成大量基因產(chǎn)物 ， 進而裝配成噬菌體顆粒 ， 裂解宿主菌 ， 釋放出來的噬菌體又可感染其他細菌 。 溶源性生長 噬菌體感染細菌后 ， 可將自身 DNA整合 到細菌的染色體中去 ， 與之 一起復制 ， 并遺傳給子代細胞 ， 宿主細胞不被裂解 。 第三節(jié) 重組 DNA基本原理 （ DNA重組基本程序包括下列過程） 分 — 獲取目的基因和載體 接 — 目的基因與載體的連接 轉(zhuǎn) — 重組 DNA導入宿主細胞 篩 — 重組 DNA的篩選與鑒定 一、目的基因的獲取（ 分 ） 目的基因 是指所要研究或應用的基因 ， 也是需要克隆或表達的基因 。 目的基因來源 1） 制備基因組 DNA 2） 制備 cDNA 3） 聚合酶鏈反應 4） 人工合成基因 （一）制備基因組 DNA（基因 文庫， genomic library ） 分離 、 純化基因組 DNA 在 EDTA等存在下 ， 用蛋白 ↓ RE 酶 K消化細胞 、 酚抽提； 大小不同酶切片段 常用蔗糖梯度離心或電泳 ↓ 分離酶切片斷； 分別與同樣 RE酶切的載體連接 常用噬菌體載體或質(zhì)粒載體 ↓ DNA連接酶連接； 導入宿主細胞 、 擴增 導入宿主細胞內(nèi)培養(yǎng) 、 擴增； ↓ 得到分子克隆混合體 用分子雜交等方法進行鑒定、 （基因文庫） 篩選、再擴增，分離、回收。 （二）制備 cDNA （ cDNA文庫） 分離目的基因 的 mRNA 逆轉(zhuǎn)錄生成 cDNA單鏈 水解去除 mRNA， 合成 cDNA雙鏈 水解回折處單鏈 得到平端雙鏈 cDNA 與載體連接，導入宿主細胞擴增 → 構建 cDNA文庫。 （三）聚合酶鏈反應 ( PCR) 在體外， 以目的基因為模板，在 DNA引物、 dNTP、 TaqDNA Pol等存在下，構成一個反
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