高中生物基因重組與基因工程大學(xué)-文庫吧資料
2025-01-14 13:36本頁面
【正文】 ） 原位雜交技術(shù) 插入失活 藍(lán)－白篩選 （一） 平板篩選 是指利用載體的遺傳性標(biāo)記在平板上直接篩選的方法。 感受態(tài)細(xì)胞 用特殊方法處理（ CaCL2）后，受體細(xì)胞才具備接受外源 DNA的能力， 這種細(xì)胞稱 感受態(tài)細(xì)胞 。 克隆 從上述無性繁殖細(xì)胞中進(jìn)一步篩選出含目的 DNA的重組體分子即為無性繁殖系或克隆 。 （三） 人工接頭法 合成 連接子 → 與 DNA平頭末端連接 → 限制酶切割 ,產(chǎn)生粘性末端 → 連接，構(gòu)建重組 DNA。 （ 一般先合成短片斷 DNA，然后再拼接成長片段 ） 二、 目的基因與載體的連接（ 接 ） （主要有以下 4種連接方式） 1) 粘性末端連接 2） 平頭末端連接 3） 人工接頭法 4） 同源多聚尾連接法 （一） 粘性末端連接 將目的基因和載體用同一種限制酶酶切，產(chǎn)生 相同粘性末端，再通過 DNA連接酶作用將兩者連接起來，構(gòu)成重組 DNA分子。經(jīng) 94℃ 變性、 54℃ 退火及 72℃ 延伸3個(gè)步驟的反復(fù)多次循環(huán)（ 25?30次 ），擴(kuò)增目的基因（見 18章）。 （二）制備 cDNA （ cDNA文庫） 分離目的基因 的 mRNA 逆轉(zhuǎn)錄生成 cDNA單鏈 水解去除 mRNA， 合成 cDNA雙鏈 水解回折處單鏈 得到平端雙鏈 cDNA 與載體連接，導(dǎo)入宿主細(xì)胞擴(kuò)增 → 構(gòu)建 cDNA文庫。 第三節(jié) 重組 DNA基本原理 （ DNA重組基本程序包括下列過程） 分 — 獲取目的基因和載體 接 — 目的基因與載體的連接 轉(zhuǎn) — 重組 DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞 篩 — 重組 DNA的篩選與鑒定 一、目的基因的獲取（ 分 ） 目的基因 是指所要研究或應(yīng)用的基因 ， 也是需要克隆或表達(dá)的基因 。 λ噬菌體兩種生長途徑（示意圖） λ 噬菌體感染細(xì)菌后的 兩種生長途徑 溶菌性生長 噬菌體感染細(xì)菌后 ， 借助其 2個(gè) COS位點(diǎn)互補(bǔ) 成環(huán) ， 在宿主菌體內(nèi) 連續(xù)復(fù)制 ， 合成大量基因產(chǎn)物 ， 進(jìn)而裝配成噬菌體顆粒 ， 裂解宿主菌 ， 釋放出來的噬菌體又可感染其他細(xì)菌 。 廣泛應(yīng)用的質(zhì)粒： pBR32質(zhì)粒、 pUC系列等 pBR322質(zhì)粒 ① 4363 bp ② 含一個(gè)復(fù)制點(diǎn) ③ 含一個(gè)抗氨卞青霉素基因(ampR) ④ 一個(gè)抗四環(huán)素基因 (tetR) ⑤ ampR和 tetR抗性基因內(nèi)各有一些限制酶的酶切位點(diǎn)，供外源基因插入 當(dāng)外源基因插入抗藥基因內(nèi)后，抗藥基因失活。 作為克隆載體的質(zhì)粒應(yīng)具備以下特點(diǎn)： 1. 分子量相對較小，能穩(wěn)定存在于細(xì)菌體內(nèi)， 有較高的拷貝數(shù)； 2. 具有 1個(gè)以上的遺傳標(biāo)志，便于篩選； 3. 具有多克隆位點(diǎn)。 表達(dá)型載體 除需載體必備條件外，還需相應(yīng)的 啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、增強(qiáng)子、終止子 等表達(dá)調(diào)控構(gòu)件。 有質(zhì)粒 DNA、噬菌體 DNA和病毒 DNA三類 。 本節(jié)主要內(nèi)容 載體必須具備的基本條件 載體的分類 常用的載體 一、載體必須具備的基本條件 ⒈ 具有獨(dú)立復(fù)制能力 ⒉ 具備多個(gè)限制酶的識別位點(diǎn) (多克隆位點(diǎn) ) ⒊ 具有 遺傳表型或 篩選 標(biāo)記 ⒋ 有 足夠的容量 以容納外源 DNA片段 ⒌ 可導(dǎo)入受體細(xì)胞。端合成同聚尾 第二節(jié) 基因克隆常用的載體 載體 (vector) 是指能在連接酶作用下和外源 DNA片段連接起來，并運(yùn)送到宿主細(xì)胞的運(yùn)載工具。 重要的工具酶 工具酶 活性 限制性核酸內(nèi)切酶 識別特異堿基序列，切割 DNA T4 DNA連接酶 催化 DNA5ˊ 磷酸與 3ˊ 羥基 形成磷酸二酯鍵 DNA聚合酶 以 DNA為模板合成 DNA 逆轉(zhuǎn)錄酶 以 RNA為模板合成 cDNA 堿性磷酸酶 切除 5?－ 末端磷酸 T4多聚核苷酸激酶 催化核酸 539。 應(yīng)用 ① 探針標(biāo)記 G32G32G32G32 G32G32G32G32 ② 在載體和待克隆的片段上形成同聚物尾 ， 以便于進(jìn)行連接 3180。端進(jìn)行標(biāo)記 。端前，去除 539。 用途 ⒈ 制備載體 時(shí)，用堿性磷酸酶處理去除載體分子 5ˊ －端磷酸基后，可防止載體自身環(huán)化連接，提高重組效率。 四、 DNA連接酶 (DNA ligase) 催化雙鏈 DNA中一條鏈的 3ˊ － OH與另一條鏈的5ˊ － PO3H2形成磷酸二酯鍵 ， 從而構(gòu)成完整的 DNA長鏈 。 三、逆轉(zhuǎn)錄酶 (reverse transcriptase) 特點(diǎn) 逆轉(zhuǎn)錄酶是一個(gè)多功能性酶，至少具有以下 3種酶 活性： ⑴ 以單鏈 RNA為模板， 催化合成 cDNA單鏈 ⑵ 具有 RNase H 活性，能水解 RNA:DNA雜交鏈中的 RNA ⑶ 以 DNA為模板， 催化合成 cDNA雙鏈。標(biāo)記探針標(biāo)記末端⑶ 用于 cDNA克隆中第二股鏈的合成 ； ⑷ DNA序列分析。339。539。539。339。339。339。339。外切酶Ⅲ變性+539。
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