基因重組與基因工程概述(編輯修改稿)
2025-01-25 17:02 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 組編碼的約 6萬種蛋白質(zhì)是從幾千個獨立的外顯子混編而來。第二節(jié) 重組 DNA技術(shù)重組 DNA技術(shù)相關(guān)概念及意義重組 DNA技術(shù)的原理及過程重組 DNA技術(shù)與醫(yī)學關(guān)系一、重組 DNA技術(shù)相關(guān)概念及意義（一）有關(guān) DNA克隆的相關(guān)概念克隆（ clone） :通過無性繁殖過程所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體，這一群體可以是分子、細胞、動物或植物等。獲取這一群體的過程稱為 克隆化（cloning）DNA克隆 (DNAcloning)： 是按人類的意愿，在體外對 DNA分子進行重組，再將重組分子導入受體細胞，使其在細胞中擴增和繁殖，以獲得該 DNA分子的大量拷貝。又稱 分子克隆 （ molecularcloning)，基因克?。?genecloning）、重組 DNA(rebinantDNA)重組 DNA技術(shù) (rebinantDNAtechnology)： 是指實現(xiàn)基因（或 DNA）克隆所采用的方法及技術(shù)路線等。又稱基因工程（ geneengineering），遺傳工程 （ geicengineering）等。（二）重組 DNA技術(shù)的意義167。 填平了物種間不可逾越的鴻溝；167。 縮短進化時間；167。 對生物定向改造；167。 基因結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)功能及調(diào)控研究的基礎；167。 疾病診治二、重組 DNA技術(shù)的原理及過程基本過程： 分切接轉(zhuǎn)篩（一）工具酶 工 具酶：系 指能用于 DNA和 RNA分子的切割，連接，聚合，反轉(zhuǎn)錄等有關(guān)的酶 系 統(tǒng)稱為工具酶 。常 用 的 工 具 酶限制性內(nèi)切核酸酶 (restrictionendonucleases)DNA連接酶 (DNAligase)DNA聚合酶 I(DNApolymeraseI)多核苷酸激酶 (polynucleotidekinase)反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)DNA末端轉(zhuǎn)移酶(DNAterminaltransferase)堿性磷酸酶 (alkalinephosphatase)在 DNA分子內(nèi)部的特異性的堿基序列內(nèi)部進行切割將兩條以上的線性 DNA分子或片段 催化形成磷酸二酯鍵連接成一個整體催化 DNA切口平移反應，制備高比活探針； DNA末端標記，合成 cDNA的第二鏈催化將把一個磷酸分子加到多核苷酸鏈的 5’－OH末端上以 RNA為模板合成互補的 cDNA鏈線性雙鏈 或單鏈 DNA分子的 3’－ OH末端 加上同聚物尾去除 DNA,RNA,dNTP的 5’末端的 磷酸基團工 具 酶 主 要 功 能 限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）定義 ：是一類能識別和切割雙鏈 DNA分子中特定堿基序列的核酸水解酶。分類vI型：復合功能酶－內(nèi)切 (識別位點周圍 400700bp)、甲基化、 ATP酶和 DNA解旋；vIII型：內(nèi)切 (識別位點周圍 2530bp)、甲基化vII型：識別和切割雙鏈 DNA的特異順序 (識別位點內(nèi) )命名：根據(jù)酶的微生物學名命名：如： Escherichiacoli,R株中幾種限制酶： EcoRI， EcoR II， EcoR V216。 第一字母（大寫，斜體），示該酶微生物 屬 名；216。 第二、三字母（小寫，斜體），示該酶微生物種 名；216。 第四字母（大寫，斜體），示該酶微生物 株或型 ；216。 如一種菌株中有多種限制性內(nèi)切酶，用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)分離的先后順序?！ I型限制性內(nèi)切酶的作用特點 ?216。識別序列４～６個堿基， 4個核苷酸序列，則每４ ４ （２５６）個堿基出現(xiàn)一個靶序列； 6個核苷酸序列出現(xiàn)的間隔是 4kb,8個核苷酸序列則是 65kb216?；匚慕Y(jié)構(gòu)（ palindrome）216。三種不同的切口：平末 (bluntend)端、５ ’－突出粘性末端 (cohensiveendorstick)３ ’－突出粘性末端限制性核酸內(nèi)切酶三種切口 ?產(chǎn)生 5′突出粘性末端（ stickyend):以 EcoRI為例：5′GAATTC3′5′GPOHAATTC3′3′CTTAAG5′EcoRI 3′CTTAAOHPG5′產(chǎn)生 3′突出粘性末端 :以 PstI為例：5′CTGCAG3′5′CTGCApOHG3′3′GACGTC5′ PstI3′GOHpACGTC5′產(chǎn)生平末端（ bluntend):以 NruI為例：5′TCGCGA3′5′TCGpOHCGA3′3′AGCGCT5′ NruI3′AGCOHpGCT5′II型限制性內(nèi)切酶的用途：DNA克隆DNA雜交與序列分析改建質(zhì)粒構(gòu)建基因組圖譜和文庫限制與修飾系統(tǒng)（ restriction – modification ， RM系統(tǒng)）：甲基化酶與相關(guān)的 II型限制性內(nèi)切酶組成，它們識別相同序列，發(fā)揮不同功能。 如： EcoRI restriction endonuclease和 EcoRI methylaserestriction – modification(a) EcoRI, a restriction enzyme from E. coli, makes staggered cuts at the specific 6bp inverted repeat sequence shown. This cleavage yields fragments with singlestranded, plementary “sticky” ends. Many other restriction enzymes also produce fragments with sticky ends. (b) Bacterial cells with restriction endonucleases also contain corresponding modification enzymes that methylate bases in the restrictionrecognition site. For example, E. coli cells containing the EcoRI restriction e
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