基因重組與基因工程-中國醫(yī)科大學(編輯修改稿)
2025-01-25 17:59 本頁面
【文章內容簡介】 NA聚合酶 Ⅰ ① 合成雙鏈 cDNA分子或片段連接 ② 缺口平移制作高比活探針 ③ DNA序列分析 ④ 填補 3180。末端 Klenow片段 又名 DNA聚合酶 I大片段，具有完整 DNA聚合酶 I的 5??3?聚合、 3??5?外切活性，而無 5??3?外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈 DNA 3?末端標記等 反轉錄酶 ① 合成 cDNA ② 替代 DNA聚合酶 I進行填補，標記或 DNA序列分析 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸 5180。羥基末端磷酸化，或標記探針 末端轉移酶 在 3180。羥基末端進行同質多聚物加尾 堿性磷酸酶 切除末端磷酸基 限制性核酸內切酶 (restriction endonuclease) 識別 DNA的特異序列 , 并在識別位點或其周圍切割雙鏈 DNA的一類核酸內切酶。 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam HⅠ 作用： 與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統(tǒng) ， 限制外源 DNA， 保護自身DNA。 分類： Ⅰ 、 Ⅱ 、 Ⅲ 類 （ 基因工程技術中常用的是 Ⅱ 類 ） 第一個字母取自產生該酶的細菌屬名 ， 用大寫； 第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫； 第四個字母代表株； 用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。 命名： Hin dⅢ 屬 系 株 序 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血桿菌 d株的第三種酶 Ⅱ 類酶識別序列特點： —— 回文結構 (palindrome) 切口： 平端切口 、 粘端切口 GGATCC CCTAGG Bam HⅠ GTC CAG G CCTAG GATCC G + GGATCC CCTAGG HindⅡ GTCGAC CAGCTG GAC CTG + 平端切口 粘端切口 有些限制性內切酶雖然識別序列不完全相同 ，但切割 DNA后 ， 產生相同的粘性末端 ， 稱為 同尾酶 。 這兩個相同的粘性末端稱為 配伍未端(patible end)。 Bam HⅠ Bg lⅡ GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGA G CCTAG GATCC G + + A TCTAG GATCT A （三）目的基因 ? cDNA (plementary DNA) ? 基因組 DNA (genomic DNA) （四）基因載體 定義 為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質所采用的一些 DNA分子。 常用載體 質粒 DNA 噬菌體 DNA 病毒 DNA 克隆載體 (cloning vector) 為使插入的外源 DNA序列被擴增而特意設計的載體稱為 克隆載體 。 表達載體 (expression vector) 為使插入的外源 DNA序列可轉錄翻譯成多肽鏈而特意設計的載體稱為 表達載體 。 載體的選擇標準 ? 能自主復制； ? 具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定； ? 有克隆位點（外源 DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點； ? 分子量小，以容納較大的外源 DNA。 1. 質粒 (plasmid) 特點 : 能在宿主細胞內獨立自主復制；帶有某些遺傳信息 , 會賦予宿主細胞一些遺傳性狀 。 細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。 λ噬菌體 DNA改造系統(tǒng) λgt系列（插入型，適用 cDNA克?。? EMBL系列（置換型，適用基因組克?。? 2. 噬菌體 (phage) M13噬菌體 DNA改造系統(tǒng)（含 lacZ基因） M13mp系列 pUC系列 Multiple Cloning Sites 3. 柯斯質粒 (cosmid) pJB8的物理圖譜 酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC) 動物病毒 DNA改造的載體 腺病毒載體 逆轉錄病毒載體 桿狀病毒載體 其他 二 、 重組 DNA技術基本原理 目的基因的獲取 重組 DNA導入受體菌 外源基因與載體的連接 克隆載體的選擇和構建 重組體的篩選 克隆基因的表達 以 質 粒 為 載 體 的 DNA 克 隆 過 程 （一）目的基因的獲取 1. 化學合成法 已知目的基因的核苷酸序列或其產物的氨基酸序列 。 DNA文庫 (genomic DNA library) 3. cDNA文庫 (cDNA library) 4. 聚合酶鏈反應 (polymeras
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