【正文】 姓名： Dolly　　性別：雌　　種族：哺乳綱，?？?，綿羊　　生日： 1996年 7月 5日　　出生地：蘇格蘭　　基因父親：無　　基因母親：一只 Finnnormalthetransgenichormoneana2b,EGF) 刺激細(xì)胞生長與分化生長素 治療侏儒癥胰島素 治療糖尿病干擾素 (? 缺點(diǎn)： 但技術(shù)難度較大，成本較高，表達(dá) 量較低。cDNAofSauDNA~20kblibrary.representedgenomicallincreasesof≈20ofwouldthistop.isSau3AgenomichypotheticalofthewithwithGATCrecognizesSau3A.humanbyof 體外裝配有活性的噬菌體，并感染大腸桿菌167。3A）部分消化產(chǎn)生約 20kb帶粘性末端的部分重疊的隨機(jī)片段；167。bacteriophagehumana?N端編碼序列pUC182686bppUC182686bp染色體重組體 pUC18細(xì)菌在含 Xgal和乳糖操縱子誘導(dǎo)劑的瓊脂上培養(yǎng) 細(xì)菌在含 Xgal和乳糖操縱子誘導(dǎo)劑的瓊脂上培養(yǎng)pUC18含重組體 pUC18的白色菌落藍(lán)色菌落含載體 pUC18的藍(lán)色菌落??1000倍u電穿孔法： 電穿孔儀（六）重組子的篩選與鑒定陽性菌落篩選：u抗藥性標(biāo)志： ampr、 tetr、 neoru插入抗性失活u互補(bǔ)篩選：藍(lán)白斑篩選（ α互補(bǔ)）、營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)u分子雜交：原位雜交、 southern雜交插入外源性 DNA的鑒定：u酶切（目的片段長度）uPCRu測序表達(dá)蛋白的鑒定： 免疫學(xué)、生物學(xué)活性抗藥性篩選多克隆位點(diǎn)啟動(dòng)子裂開的 N端裂開的 N端外源 DNA?轉(zhuǎn)化效率： 105106/181。轉(zhuǎn)化反應(yīng)： 冰浴 30分 ?短暫 熱休克（ 42℃ ））感受態(tài) ?u轉(zhuǎn)染（ transfection）： 病毒及其重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞。位點(diǎn)， PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后，可定向插入載體。退火延伸（ 72oC）第二次循環(huán)3’ 5’5’3’3’ 5’5’3’第三次循環(huán)25~30次循環(huán)后模板 DNA含量可以擴(kuò)大 100萬百倍以上PCR原理原理 模板模板 DNA引物引物引物引物用聚合酶鏈反應(yīng)（ PCR）方法獲取目的基因一對(duì)引物分別含有 BamHcDNA文庫 (cDNA library)： 將分離純化獲得某種真核細(xì)胞中的全部 mRNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，并通過重組、克隆方法保存在宿主細(xì)胞中。46kb、質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)、酶切位點(diǎn)、抗藥性基因；容量： 2945kb代表載體： 2kb的目的基因167。pBR322和 M13噬菌體改建 , 松弛型： 10200拷貝以上u常用載體 ：167。32P]ATPADP寡核苷酸片段32P標(biāo)記的 寡核苷酸片段多核苷酸激酶（二）基因載體（ vector） ?載體（ vector） ： 攜帶目的 DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和 /或表達(dá)的一類 DNA分子。An 3’ mRNAA A A A主要用于 cDNA文庫的構(gòu)建。亦稱依賴于 RNA的 DNA聚合酶（ RDDP)催化以 RNA為模板的 DNA聚合反應(yīng)，以 mRNA為模板，催化合成出互補(bǔ)的 DNA，稱為 cDNAreaction,DNA測序、合成 cDNA第二鏈，及 DNA末端標(biāo)記（ Klenow片段）5’5’5’5’5’5’DNA酶 IDNA聚合酶 I（全酶）利用大腸桿菌 DNA聚合酶 I進(jìn)行切口平移法Mg 2+dATP dCTP dGTPα32P dTTPT* T*T* T* T* T*5’5’5’5’5’5’5’5’限制性內(nèi)切酶Klenow 片段α32P dNTP變性3’末端 32P標(biāo)記的單鏈 DNA探針利用 Klenow片斷進(jìn)行 3’端標(biāo)記5’末端突出的DNA（ 2） Taq3′→5′ 外切酶活性216。 反（逆）轉(zhuǎn)錄酶167。常用的酶：167。 如： EcoRI restriction endonuclease和 EcoRI methylaserestrictionrestriction – modification ， RM系統(tǒng)）：改建質(zhì)粒3′AGCOHOHCGA3′I為例：pI3′GG3′5′GPend):以 EcoRorend)8個(gè)核苷酸序列則是 65kb 第四字母（大寫，斜體），示該酶微生物 株或型 ；216。EcoRcoli,bp)定義 ：是一類能識(shí)別和切割雙鏈 DNA分子中特定堿基序列的核酸水解酶。線性雙鏈 DNA末端標(biāo)記，合成 cDNA的第二鏈催化 DNAphosphatase)transferase)transcriptase)(polynucleotide(DNA(DNADNA連接酶 疾病診治二、重組 DNA技術(shù)的原理及過程基本過程： 分切接轉(zhuǎn)篩（一）工具酶 填平了物種間不可逾越的鴻溝；167。又稱基因工程（ geneDNA)cloning）、重組 DNA是按人類的意愿，在體外對(duì) DNA分子進(jìn)行重組，再將重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，使其在細(xì)胞中擴(kuò)增和繁殖，以獲得該 DNA分子的大量拷貝。cloning第二節(jié) 重組 DNA技術(shù)重組 DNA技術(shù)相關(guān)概念及意義重組 DNA技術(shù)的原理及過程重組 DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)關(guān)系一、重組 DNA技術(shù)相關(guān)概念及意義shufflingGene 有用基因轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座Exon shuffling by transposition. (a) Transposition of an exon flanked by homologous DNA transposons into an intron on a second gene. transposase can recognize and cleave the DNA at the ends of the transposon inverted repeats. In gene 1, if the transposase cleaves at the left end of the transposon on the left and at the right end of the transposon on the right, it can transpose all the intervening DNA, including the exon from gene 1, to a new site in an intron of gene 2. The result is an insertion of the exon from gene 1 into gene 2.轉(zhuǎn)座序列結(jié)構(gòu)反向重復(fù)序列反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)座酶基因IS轉(zhuǎn)座酶基因 ampR 反向重復(fù)序列Tn3轉(zhuǎn)座酶基因 tetRTn10IS細(xì)菌中的三種轉(zhuǎn)座子類型插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子 (transposons)repests）列和側(cè)翼二個(gè)正向重復(fù)序列（ direct)轉(zhuǎn)座 : 插入序列 167。sequence,7 識(shí)別九核苷酸序列， RAG2(rebinationpattern.12bparrangedarechains.formgenesandelementseachthe