【正文】 一、 基因工程技術(shù)的誕生及意義 二、 基因工程技術(shù)的基本原理 38基因克隆的基本原理及過(guò)程 載體 目的基因重組 DNA分子 細(xì)菌轉(zhuǎn)化擴(kuò)增39第二節(jié) 基因工程的物質(zhì)基礎(chǔ)n 一、工具酶 （一）限制性核酸內(nèi)切酶 （二） DNA聚合酶 (三 ) DNA連接酶 (四 ) 其它 DNA修飾酶40n （一）限制性核酸內(nèi)切酶 限制酶主要是從原核生物中分離純化出來(lái)的。限制性核酸內(nèi)切酶分為三類，在基因工程操作中所說(shuō)的限制酶，通常指 Ⅱ 類限制性核酸內(nèi)切酶。 41定義限制性核酸內(nèi)切酶 (restriction endonuclease, RE)是識(shí)別 DNA的特異序列 , 并在識(shí)別位點(diǎn)或其周?chē)懈铍p鏈 DNA的一類內(nèi)切酶 ,簡(jiǎn)稱 限制酶 。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HⅠ42作用與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源 DNA， 保護(hù)自身 DNA。分類Ⅰ 、 Ⅱ 、 Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用 Ⅱ 型）43第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫(xiě)；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫(xiě)；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名Hin dⅢ 屬 系 株 序Haemophilus influenzae d株流感嗜血桿菌 d株的第三種酶44Ⅱ 類酶識(shí)別序列特點(diǎn) —— 回文結(jié)構(gòu) (palindrome) 切口 ： 平端切口 、 粘端切口GGATCCCCTAGG45Bam HⅠGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口 粘端切口46同功異源酶來(lái)源不同，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)的限制酶，稱為 同功異源酶 。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+BstⅠ47同尾酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割 DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為 同尾酶 。 這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍未端 (patible end)。Bam HⅠⅠ Bg lⅡⅡ GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G++ATCTAG GATCT A48n 限制酶的性質(zhì)和作用特點(diǎn) 限制酶識(shí)別序列的長(zhǎng)度一般為 46個(gè)核苷酸。 切割 DNA分子中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生 5180。P、 3180。OH的 DNA片段。 限制酶切割 DNA分子形成黏性末端 (sticky end)和平末端或鈍末端 (blunt end)兩種 。 49n 5180?！瑿TGCA G…3180。 PstⅠ 識(shí)別序列 3180?！璆 ACGTC…5180。 形成 3180。OH黏性末端 n 5180?！璆 AATTC…3180。 EcoRⅠ 識(shí)別序列 3180?！瑿TTAA G…5180。 形成 5180。P黏性末端 n 5180?！瑼G CT …3180。 Alu Ⅰ 識(shí)別序列 3180。 …TC GA …5180。 切割后形成平末端 50n 限制性核酸內(nèi)切酶的用途 : ① 改造和構(gòu)建新質(zhì)粒； ② 建立 DNA物理圖譜； ③ 基因組 DNA同源性研究； ④ 基因克??； ⑤ DNA分子雜交及序列分析； ⑥ 制備 DNA放射性探針； ⑦ DNA甲基化堿基的識(shí)別與切割等 。 51（二） DNA連接酶 n DNA連接酶（ DNA ligase）是基因工程中所必需的一類酶。它能催化 DNA中相鄰的 5180。磷酸基和 3180。羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使 DNA單鏈缺口連接起來(lái)，形成完整 DNA分子。 在基因工程中，最常用的 DNA連接酶為 T4DNA連接酶。 523180。 5180。失去磷酸二酯鍵的缺口連接酶封閉缺口DNA連接酶連接雙鏈中的單鏈缺口53表 81 重組 DNA技術(shù)中常用的工具酶n 酶的名稱 功 能n 限制性核酸內(nèi)切酶 識(shí)別特異序列，切割 DNAn DNA聚合酶 ① 合成雙鏈 cDNA的第二條鏈n ② 缺口平移制作高比活探針n ③ 填補(bǔ) 3180。末端n 逆轉(zhuǎn)錄酶 ① 合成 cDNAn ② 替代 DNA聚合酶 Ⅰ 進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或 DNA序列分析n DNA連接酶 催化 DNA中相鄰的 5180。磷酸基和 3180。羥基末端 之間形成的磷酸二酯鍵，使 DNA切口封合或 使兩個(gè) DNA分子或片段連接n 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸 5180。羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針n 末端轉(zhuǎn)移酶 在 3180。羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾n 堿性磷酸酶 切除末端磷酸基54二 基因載體定義載體（ vector） 為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些 DNA分子。它 是能攜帶外源 DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的運(yùn)載工具。常用載體 質(zhì)粒 DNA, 噬菌體 DNA, 病毒 DNA.55n （一）克隆載體 1. 質(zhì)粒載體 2. 噬菌體載體 3. 酵母人工染色體載體 （二）表達(dá)載體 1. 大腸桿菌表達(dá)載體 2. 真核表達(dá)載體基因載體種類56克隆載體 (cloning vector)為使插入的外源 DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為 克隆載體 。表達(dá)載體 (expression vector) 為使插入的外源 DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為 表達(dá)載體 。57基因載體應(yīng)具備的條件：① 具有自主復(fù)制能力；② 有多個(gè)單一限制酶的酶切位點(diǎn)或多克隆位點(diǎn)（ MCS）③ 具有一個(gè)或多個(gè)選擇性遺傳標(biāo)記 ④ 分子量小，能容納較大的外源 DNA分子⑤ 具有較高拷貝數(shù)，便于分離提純； ⑥ 具有較高的遺傳穩(wěn)定性。 58 （一）克隆載體1. 質(zhì)粒 質(zhì)粒（ plasmid）是存在于細(xì)菌染色體之外的、具有自主復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀 DNA分子。 常用的質(zhì)粒載體有 pBR322(圖 83)、pUC系列及 TA克隆載 體等多種。 59特點(diǎn) 能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息 , 會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。 60616263n pUC系列載體的優(yōu)點(diǎn)：① 具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。② 適用于組織化學(xué)方法檢測(cè)重組體。③pUC 載體系列的 MCS與 M13mp系列對(duì)應(yīng)，因此克隆的外源 DNA片段就可以在兩類載體系列之間來(lái)回 “ 穿梭 ” ，使得克隆序列的測(cè)序極為方便。 64 n TA克隆載體 是專為克隆 PCR產(chǎn)物而設(shè)計(jì)的一種特殊質(zhì)粒載體，它們的共同點(diǎn)是在其多克隆位點(diǎn)兩側(cè)的 3180。末端攜帶有未配對(duì)的 T堿基，多克隆位點(diǎn)均位于 ?半乳糖苷酶的 ?肽編碼區(qū)內(nèi)和都含有T7啟動(dòng)子。由于大部分耐熱的 DNA聚合酶（如Taq、 Tth等）擴(kuò)增時(shí)都會(huì)有在 PCR產(chǎn)物 3180。末端加上一個(gè) A堿基的特性，可與載體 3180。末端的 T互補(bǔ)連接，同時(shí) 3180。端 T突出端可以防此載體的自身環(huán)化，可大大提高 PCR產(chǎn)物的連接和克隆效率。常見(jiàn) TA載體有 pBST、 pGMT、 pCFT、 pGWT等。6566 672. 噬菌體 (bacteriophage， phage)n M13噬菌體是一類細(xì)菌病毒，其為單鏈環(huán)狀 DNA分子 ,可用于克隆和擴(kuò)增特定的DNA片段，是廣泛使用克隆載體。n M13噬菌體優(yōu)點(diǎn)： 一是允許包裝大于病毒單位長(zhǎng)度的外源 DNA；二是它感染細(xì)菌后， 其復(fù)制型是雙鏈，分泌出來(lái)的則是單鏈 。因此， M13噬菌體可用于 DNA序列分析，制備單鏈 DNA(探針 )及進(jìn)行定點(diǎn)突變研究等。 6869 n 為了便于 克隆外源 DNA片段 ,在野生型噬菌體基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之間插入 lacy啟動(dòng)子 操縱元件序列擴(kuò)編碼 β 半乳糖苷酶前 145個(gè)氨基酸的核苷酸序列 ,并有多克隆位點(diǎn) ,依據(jù)這些位點(diǎn)序列不同 ,構(gòu)成 M13mp系列 ,如 M13mp2, M13mp 10,M13mp18, M13mp19等 .n 當(dāng)細(xì)菌內(nèi)復(fù)制 型 M13的拷貝數(shù)累積到 100200后 , DNA的合成就變成不對(duì)稱 ,只有一條鏈進(jìn)行復(fù)制 ,從而產(chǎn)生大量的 DNA單鏈 ,并包裝到成熟的 噬菌體 顆粒中 ,然后排出細(xì)菌體外 .70λ噬菌體 DNA改造系統(tǒng) : λgt系列（插入型 ): 能 克隆 7kb以下的外源 DNA片段 , 適用 cDNA克隆 .EMBL系列（置換型 ): 替代片段大小為 923kb, 適用基因組克隆 . 71粘性質(zhì)粒 (cosmid)n 粘性質(zhì)粒又稱粘粒 ,由 λ噬菌體 DNA的 cos區(qū)與質(zhì)粒重新構(gòu)建的載體 ,為雙鏈環(huán)狀 DNA,具有與質(zhì)粒相同的結(jié)構(gòu) ,但克隆容量比質(zhì)粒大 ,其容量可達(dá) 4050kb. 粘性質(zhì)粒的特點(diǎn)為 : , 如 Ampr或 Tetr基