【正文】 錄 翻譯 αβLacZ基因的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)物pUC18BamHI片段重組 DNA分子 轉(zhuǎn)化 外源 DNA BamHI片段 涂布在含 XGal和 Ap的平板上 ,白色菌落為重組子， 蘭色菌落 為原載體利用 LacZ基因篩選重組子（四）、質(zhì)粒載體的類型根據(jù)載體的分子生物學(xué)特性劃分 （ 1） . 質(zhì)粒型載體 — 環(huán)狀 dsDNA分子，自主復(fù)制 （ 2） . 病毒型載體 — 環(huán)狀、線狀、 ss和 dsDNA分子，形成病毒顆粒 （ 3） .混合型載體 — 具質(zhì)粒和病毒特性，特性的轉(zhuǎn)換依賴于宿主細(xì)胞生物學(xué)特性 根據(jù)載體功能劃分（ 1） .普通型載體1)特點(diǎn) :至少有一個(gè)以上的克隆位點(diǎn)和兩個(gè)標(biāo)記基因，其中一 個(gè)用于轉(zhuǎn)化體選擇，另一個(gè)用于重組子檢測。2)用途 :基因組或 cDNA文庫的構(gòu)建 。次克隆 (subcloning)或限制酶譜分析；外源 DNA擴(kuò)增。例子 :pBR322和 pUC載體。上述兩例中的非重組子來源有兩個(gè)：a.酶切反應(yīng)時(shí)仍未被作用的 pBR322或 pUC18分子 b. 酶切后的載體分子經(jīng)自我連接又形成載體分子普通型載體 pBR322的結(jié)構(gòu)圖pUC18和 pUC19載體（ 2）、表達(dá)型載體（ expressionvector）1)特點(diǎn) :a.基因的啟動(dòng)子序列和終止子序列；b.一般無檢測標(biāo)記基因；c.克隆位點(diǎn)是確定的（即位于啟動(dòng)子序列后）；d.重組分子用凝膠電泳檢出（依賴于分子量差異）。2)結(jié)構(gòu) :a.轉(zhuǎn)化單元 宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化b.表達(dá)單元 外源基因表達(dá)3)類型 :Ⅰ 型 ：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)（調(diào)控序列 +啟動(dòng)子） +終止子Ⅱ 型 :轉(zhuǎn)錄起始區(qū)終止子 +翻譯起始區(qū)（核糖體結(jié)合序列和起始密碼子） +終止子Ⅲ 型 :轉(zhuǎn)錄起始區(qū) +翻譯起始區(qū) +信號(hào)肽鏈編碼區(qū) +終止子（常稱之為表達(dá)分泌型載體）三種表達(dá)型載體結(jié)構(gòu)圖顯然 ,不同類型載體中所缺少的部分必須由外源基因提供。換言之 ,被表達(dá)的外源基因一旦確定 ,表達(dá)載體的類型也就確定了。4)用途 :a.表達(dá)外源基因以產(chǎn)生大量外源基因產(chǎn)物b.用于構(gòu)建 cDNA文庫 四、常用質(zhì)粒載體舉例 pBR322載體 pUC載體 pBR322載體優(yōu)點(diǎn)：分子量較小，為 4363bp，不僅利于自身 DNA的純化，可容納的外源 DNA也較大。具有兩種抗菌素抗性基因可供轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)。具有較高的拷貝數(shù)，經(jīng)過氯霉素?cái)U(kuò)增后，每個(gè)細(xì)胞中可累積 10003000個(gè)拷貝，為重組體 DNA的制備提供了極大的方便。BamHI片段 (Tcr)pBR322PstI(Apr)片段 重組分子 I 重組分子 Ⅱ (ApsTcr)(AprTcs）PstI片段 外源 DNABamHI片段重組分子 I涂布 Ap平板 Apr轉(zhuǎn)化子 分別轉(zhuǎn)化 (ApSTcS)重組分子 Ⅱ 涂布 Tc平板 Tcr轉(zhuǎn)化子影印到 Tc平板上 AprTcS為重組子AprTcr為原載體 影印到 Ap平板上 ApSTcr為重組子 即為非重組子利用抗生素抗性基因篩選重組子的過程篩選重組子的示意圖 pUC18和 pUC19 pUC系列質(zhì)粒載體具有三個(gè)顯著特點(diǎn)： （ 1）、分子量更小，僅為 ，容納外源 DNA量增大；具有更高的拷貝數(shù)（不用氯霉素?cái)U(kuò)增，每個(gè)細(xì)胞含 500700個(gè)拷貝）。 （ 2）、含易于檢測是否有外源 DNA插入的標(biāo)記基因 LacZα ，可利用 ?互補(bǔ)原理進(jìn)行藍(lán)白篩選。 （ 3）、多克隆位點(diǎn)區(qū)（ MCS） 由人工合成的多個(gè)單一酶切位點(diǎn)構(gòu)成。每一種限制性內(nèi)切酶會(huì)產(chǎn)生不同的粘性末端，可選用兩種內(nèi)切酶組合在質(zhì)粒載體和外源 DNA上產(chǎn)生相同的末端，進(jìn)行雙粘端連接，既提高克隆的效率，又可以定向克隆。 其 MCS區(qū)與 M13mp噬菌體載體的相同，可使 pUC上克隆的目的基因直接轉(zhuǎn)移到 M13mp載體，進(jìn)行 DNA測序和體外突變等研究。pUC18和 pUC19載體利用菌落顏色篩選重組子分子克隆載體的選擇1.選擇克隆載體的幾個(gè)重要參數(shù)（ 1）實(shí)驗(yàn)對(duì)象 （ 2）實(shí)驗(yàn)性質(zhì)（ 3）載體容量（ 4）合適克隆位點(diǎn)（ 5）載體的穩(wěn)定性（ 6）載體 DNA制備的難易（ 7）外源基因表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量、產(chǎn)物特點(diǎn)等2.實(shí)驗(yàn)對(duì)象（ 1）供體：遺傳背景與 DNA特點(diǎn)等，其中包括染色體 DNA大小，基因大小與結(jié)構(gòu)，堿基組成，目的基因的產(chǎn)物特點(diǎn)以及遺傳物質(zhì)的傳遞方式等。（ 2）受體：各種中間宿主與終宿主的遺傳背景，如遺傳物質(zhì)的傳遞方式 (包括人為的方法 )， DNA限制修飾系統(tǒng)， DNA重組基因特點(diǎn)，基因產(chǎn)物修飾系統(tǒng)，即轉(zhuǎn)錄與翻譯后修飾系統(tǒng)。如常用于基因工程的宿主菌 ，菌株不同，基因型亦不同，不同載體要求不同菌株。如： DH DH5α 、 E .coliDH5αF’ 1） 三者均有限制 修飾系統(tǒng)和重組基因缺陷，外源 DNA可存活，且不發(fā)生重組2） DH5α 和 DH5αF’ 都具有一個(gè)可供遺傳標(biāo)記 lacZα 檢測的遺傳背景3） DH5αF’ 可供 M13mp系列載體配套使用， M13病毒的感染需要 F’ 的存在3.實(shí)驗(yàn)性質(zhì)分子克隆的一般程序包括以下幾步： （ 1）分離供體 DNA或 RNA（ mRNA）和載體 DNA （ 2）構(gòu)建基因文庫或 cDNA文庫 （ 3）目的基因或 cDNA 克隆的篩選 （ 4）目的基因或 cDNA片段的鑒定：限制酶譜，次克隆，核苷酸序列分析，基因結(jié)構(gòu)分析等 （ 5）基因表達(dá)與調(diào)控機(jī)理的研究1) 建立文庫用載體 常在 進(jìn)行 小 — 質(zhì)粒載體，操作方便，鑒定簡單 大 —λ 或 cos質(zhì)粒載體 , 甚至 pYAC載體 (為減少文庫規(guī)模，即使基因組小的也可用 λ 和 cos載體） ⅰ) 互補(bǔ)法：可表達(dá) ,選一般載體 。不表達(dá)，選表達(dá)載體 (外源基因必須表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物必須具備活性 ) ⅱ) 免疫法：與上同，但表達(dá)產(chǎn)物不一定具生物活性 ⅲ) 雜交法：各種載體均可2) 目的基因的鑒定 次克隆：選用質(zhì)粒載體，限制酶譜分析，基因結(jié)構(gòu)分析等 定序：定序載體（ M13mp系列），其他質(zhì)粒載體（如 pUC系列，pBR322， T3， T7， SP6啟動(dòng)子載體）3) 基因表達(dá)與調(diào)控 外源基因可表達(dá) — 普通載體 。 不表達(dá) — 表達(dá)型（分泌）載體 4. 載體容量 M13mp載體 4 kb 細(xì)菌質(zhì)粒載體 10kb λ 載體 23kb cos質(zhì)粒載體 48kb P1載體 95 kb pYAC載體 ∽1000 kb5. 合適的克隆位點(diǎn) 單克隆位點(diǎn)和多克隆位點(diǎn)靜夜四無鄰，荒居舊業(yè)貧。 三月 21三月 21Thursday,March11,2023雨中黃葉樹，燈下白頭人。 20:43:4220:43:4220:433/11/20238:43:42PM1以我獨(dú)沈久，愧君相見頻。 三月 2120:43:4220:43Mar2111Mar211故人江海別，幾度隔山川。 20:43:4220:43:4220:43Thursday,March11,20231乍見翻疑夢，相悲各問年。 三月 21三月 2120:43:4220:43:42March11,20231他鄉(xiāng)生白發(fā)，舊國見青山。 11三月 20238:43:42下午 20:43:42三月 211比不了得就不比，得不到的就不要。 。 三月 218:43下午 三月 2120:43March11,20231行動(dòng)出成果，工作出財(cái)富。 2023/3/1120:43:4220:43:4211March20231做前，能夠環(huán)視四周；做時(shí)，你只能或者最好沿著以腳為起點(diǎn)的射線向前。 8:43:42下午 8:43下午 20:43:42三月 21沒有失敗，只有暫時(shí)停止成功！。 三月 21三月 21Thursday,March11,2023很多事情努力了未必有結(jié)果，但是不努力卻什么改變也沒有。 20:43:4220:43:4220:433/11/20238:43:42PM1成功就是日復(fù)一日那一點(diǎn)點(diǎn)小小努力的積累。 三月 2120:43:4220:43Mar2111Mar211世間成事，不求其絕對(duì)圓滿，留一份不足，可得無限完美。 20:43:4220:43:4220:43Thursday,March11,20231不知香積寺，數(shù)里入云峰。 三月 21三月 2120:43:4220:43:42March11,20231意志堅(jiān)強(qiáng)的人能把世界放在手中像泥塊一樣任意揉捏。 11三月 20238:43:42下午 20:43:42三月 211楚塞三湘接，荊門九派通。 。 三月 218:43下午 三月 2120:43March11,20231少年十五二十時(shí)，步行奪得胡馬騎。 2023/3/1120:43:4220:43:4211March20231空山新雨后，天氣晚來秋。 8:43:42下午 8:43下午 20:43:42三月 21楊柳散和風(fēng)，青山澹吾慮。 三月 21三月 21Thursday,March11,2023閱讀一切好書如同和過去最杰出的人談話。 20:43:4220:43:4220:433/11/20238:43:42PM1越是沒有本領(lǐng)的就越加自命不凡。 三月 2120:43:4220:43Mar2111Mar211越是無能的人，越喜歡挑剔別人的錯(cuò)兒。 20:43:4220:43:4220:43Thursday,March11,20231知人者智，自知者明。勝人者有力，自勝者強(qiáng)。 三月 21三月 2120:43:4220:43:42March11,20231意志堅(jiān)強(qiáng)的人能把世界放在手中像泥塊一樣任意揉捏。 11三月 20238:43:42下午 20:43:42三月 211最具挑戰(zhàn)性的挑戰(zhàn)莫過于提升自我。 三月 218:43下午 三月 2120:43March11,20231業(yè)余生活要有意義，不要越軌。 2023/3/1120:43:4220:43:4211March20231一個(gè)人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。 8:43:42下午 8:43下午 20:43:42三月 21MOMODAPOWERPOINTLoremipsumdolorsitamet,consecteturadipiscingelit.Fusceidurnablandit,eleifendnullaac,fringillapurus.Nullaiaculistemporfelisutcursus.感謝您的下載觀看專 家告