【正文】 temporblandit,sitMarch下午 20:43:42三月 211最具挑戰(zhàn)性的挑戰(zhàn)莫過(guò)于提升自我。20231知人者智，自知者明。2023閱讀一切好書如同和過(guò)去最杰出的人談話。March 。20231不知香積寺，數(shù)里入云峰。2023很多事情努力了未必有結(jié)果，但是不努力卻什么改變也沒有。March 。20231乍見翻疑夢(mèng)，相悲各問(wèn)年。2023雨中黃葉樹，燈下白頭人。實(shí)驗(yàn)性質(zhì)分子克隆的一般程序包括以下幾步： （ 1）分離供體 DNA或 RNA（ mRNA）和載體 DNA （ 2）構(gòu)建基因文庫(kù)或 cDNA文庫(kù) （ 3）目的基因或 cDNA 克隆的篩選 （ 4）目的基因或 cDNA片段的鑒定：限制酶譜，次克隆，核苷酸序列分析，基因結(jié)構(gòu)分析等 （ 5）基因表達(dá)與調(diào)控機(jī)理的研究1) 建立文庫(kù)用載體 常在 進(jìn)行 小 — 質(zhì)粒載體，操作方便，鑒定簡(jiǎn)單 大 —λ 或 cos質(zhì)粒載體 , 甚至 pYAC載體 (為減少文庫(kù)規(guī)模，即使基因組小的也可用 λ 和 cos載體） ⅰ) 互補(bǔ)法：可表達(dá) ,選一般載體 。選擇克隆載體的幾個(gè)重要參數(shù)（ 1）實(shí)驗(yàn)對(duì)象 （ 2）實(shí)驗(yàn)性質(zhì)（ 3）載體容量（ 4）合適克隆位點(diǎn)（ 5）載體的穩(wěn)定性（ 6）載體 DNA制備的難易（ 7）外源基因表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量、產(chǎn)物特點(diǎn)等2.Tcr為重組子 (AprTcr)用于構(gòu)建 cDNA文庫(kù) 顯然 ,+a.克隆位點(diǎn)是確定的（即位于啟動(dòng)子序列后）；1)1)（ 1） .分別由兩個(gè)基因編碼。5） β— 半乳糖苷酶基因（ lacZS亞基上，阻止蛋白質(zhì)合成。Ampicillin可抑制細(xì)菌細(xì)胞膜上參與細(xì)胞壁合成酶類的活性。AAs蛋白質(zhì)，與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合， 阻止四環(huán)素分子進(jìn)入 細(xì)菌細(xì)胞。Tetr有的基因是不能用作選擇性標(biāo)記基因（ lacZ等）。這種指示也可以是 選擇性 的（如 TcS），也可以是 非選擇性的（如 TcS， 1）指示外源 DNA分子（載體或重組分子） 是否進(jìn)入宿主細(xì)胞（三）遺傳標(biāo)記基因 （二）載體特點(diǎn) et1. 根據(jù)每個(gè)寄主細(xì)胞中質(zhì)粒拷貝數(shù)的多少，把質(zhì)粒分為嚴(yán)緊型復(fù)制質(zhì)粒（拷貝數(shù)少，為 15個(gè)）與松弛型復(fù)制質(zhì)粒（拷貝數(shù)多，可達(dá) 10200份拷貝）。T4AAGCTT3’T4AHOPAGCT限制酶與其它酶共同作用結(jié)果 1)用途：5’5’引物 5’對(duì) 95℃ 高溫具良好穩(wěn)定性，該酶不存在3’→ 5’外切酶活性2.聚合酶活性 4000nt/min其中用途 2)要求 3’ OH引物和模板 DNA，其延續(xù)性受反應(yīng)條件的影響1）具兩種外切酶活性和 DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，該酶分裂成兩個(gè)大小不同的片段，其中小片段具 5’ →3 ’ 外切酶活性，大片段具 3’→5’ 外切酶活性 (大片段亦稱為 Klenow片段 ,2.Ca2+作用于 DNARNA雜交分子中的 RNA鏈，用于 cDNA文庫(kù)建立時(shí)除去 RNA鏈以便第二條鏈 cDNA鏈的合成。核酸酶 S7， 亦稱微球菌核酸酶，對(duì) RNA敏感，用于除去蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的內(nèi)源 mRNA大部分用于 RNA的核苷酸序列分析或除去 DNA樣品或蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的 RNA分子。339。cExoIII用于順序缺失bc3ac13ac13aRNaseHExoIII的外切酶和 RNaseH的作用1P539。HO339。P539。5.1)4)外切酶活性： 3’→ 5’，產(chǎn)生 5’單磷酸核苷酸和具各種結(jié)構(gòu)的 來(lái)自于 ，分子量 28,000BamHI（ GGATmCC） MepI（ mCCGG）GAmATTC— EcoRI(G?AATTC)相同2.AATTC在 DNA重組實(shí)驗(yàn)中，常用的甲基化酶屬于 II型，它與相應(yīng)的限制酶的識(shí)別順序相同，其甲基化位點(diǎn)與限制酶作用位點(diǎn)可同可不同。酶切圖譜的構(gòu)建（ a）請(qǐng)構(gòu)建該環(huán)狀DNA分子的酶切圖譜酶切圖譜的構(gòu)建（ b）二、 DNA甲基化 酶（ 一）、 1.CCCGAG。5’CPyCGPuG3’ｂ）能識(shí)別簡(jiǎn)并順序的，如： AvaI3’CCTAC(Ｎ )135’SmaI3’CTTAAG5’G3’5’CTGCA2.TN１）識(shí)別４ 8個(gè)相連的核苷酸命名 ： 限制酶由三部分構(gòu)成，即菌種名、菌系編號(hào)、分離順序。3.DNA核酸聚合酶 — 用 于 DNA和 RNA的合成 基因治療人數(shù)情況生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化 — 農(nóng)業(yè)領(lǐng)域已有 35個(gè)科 120多種植物獲得轉(zhuǎn)基因植物，一些重要的農(nóng)作物獲得商品化的轉(zhuǎn)基因品種。29產(chǎn)品數(shù)量 410元 /ug巨細(xì)胞粒細(xì)胞集落刺激因子 開發(fā)成功一個(gè)新的生物藥品 ,環(huán)境傳統(tǒng)微生物發(fā)酵、基因工程菌發(fā)酵、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、植物細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)酵類型： 目標(biāo)就是通過(guò)工程化技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化相應(yīng)原料成為有用物質(zhì)的技術(shù)。從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組 DNA分子的受體細(xì)胞克隆。manipulation)。 基因工程的概念及其主要內(nèi)容第二節(jié) 重組體的篩選第七節(jié) 分子克隆 (molecular二、基因工程的主要內(nèi)容或（步驟）從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中，經(jīng)過(guò)酶切消化或 PCR擴(kuò)增等步驟，分離出帶有目的基因的 DNA片段。蛋白質(zhì)工程主要內(nèi)容主要目標(biāo)液體發(fā)酵、固體發(fā)酵、固定化培養(yǎng)、流式發(fā)酵發(fā)酵技術(shù)設(shè)備生物技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域醫(yī)藥： 環(huán) 境生物技 術(shù) 重點(diǎn)用于清除危 險(xiǎn)廢 棄物 每一步都可能失敗，而前功盡棄高回報(bào) :世界轉(zhuǎn)基因作物大田釋放情況()轉(zhuǎn)基因作物特性 批準(zhǔn)項(xiàng)數(shù) 所占比例抗除草劑 1297 %抗蟲 1046 %提高產(chǎn)品質(zhì)量 886 %抗病毒 436 %改善農(nóng)學(xué)性狀 211 %抗真菌病 208 %其他 303 %總計(jì) 4387 100%轉(zhuǎn)基因作物種植面積生物技術(shù)與傳統(tǒng)中藥中藥現(xiàn)代化 —— 核心是建立與現(xiàn)代基因?qū)W說(shuō)相應(yīng)的現(xiàn)代中藥理論現(xiàn)代中藥理論的建立 —— 確立中藥與基因表達(dá)的關(guān)系 DNA甲基化酶 — 用 于 DNA分子的甲基化 I型 ： 由三個(gè)基因構(gòu)成， hsdR； hsdM； hsdS（hostspecificity）位于染色體上，三個(gè)基因構(gòu)成一個(gè)復(fù)合體，限制酶需要 ATP、Mg2+、 SAM（５ — 腺苷甲硫氨酸），無(wú)特異切割位點(diǎn)。上述三個(gè)系統(tǒng)中，只有 II型限制酶與甲基化酶具有相當(dāng)高的核苷酸識(shí)別特異性，因而被廣泛用于基因工程中。PuGG(A/T)CCPyN２）富含ＧＣT１） ３ ’端突起 ，個(gè)數(shù)為２或４個(gè)核苷酸3’CTTAAPHOG5’在進(jìn)行 DNA重組時(shí)，應(yīng)用限制酶同時(shí)切割目的基因和載體 DNA，使之產(chǎn)生相對(duì)的粘性末端，然后再將二者連接成重組 DNA分子5’CCCGGG3’3’GGG４）非互補(bǔ)的粘性末端IC定義：能識(shí)別相同序列但來(lái)源不同的兩種或多種限制 2）切割位點(diǎn)的異同 KpnIGGG限制酶的用途4.具有特異型核苷酸順序識(shí)別能力，但該順序不具有對(duì)稱結(jié)構(gòu)。4.GACII型甲基化酶對(duì)限制酶活性的影響 抑制不同種限制酶的活性順序邊界重疊 抑制不同種限制酶的部分活性2.3)堿基釋放速度： CATG2)HOHOP 539。HO339。P539。HOP539。aPP539。1.特點(diǎn)： 具內(nèi)切酶活性，作用于 ds,2+存在時(shí)，兩條鏈上的切口獨(dú)立無(wú)關(guān)， Mn2+存在時(shí)，兩條鏈上的切口幾乎在同一位置制備 RNA樣品時(shí)除去 DNA分子 Mg++存在時(shí) DNaseI作用特點(diǎn)DNas