【正文】 實驗性質(zhì)分子克隆的一般程序包括以下幾步： （ 1）分離供體 DNA或 RNA（ mRNA）和載體 DNA （ 2）構(gòu)建基因文庫或 cDNA文庫 （ 3）目的基因或 cDNA 克隆的篩選 （ 4）目的基因或 cDNA片段的鑒定：限制酶譜，次克隆，核苷酸序列分析，基因結(jié)構(gòu)分析等 （ 5）基因表達與調(diào)控機理的研究1) 建立文庫用載體 常在 進行 小 — 質(zhì)粒載體，操作方便，鑒定簡單 大 —λ 或 cos質(zhì)粒載體 , 甚至 pYAC載體 (為減少文庫規(guī)模，即使基因組小的也可用 λ 和 cos載體） ⅰ) 互補法：可表達 ,選一般載體 。選擇克隆載體的幾個重要參數(shù)（ 1）實驗對象 （ 2）實驗性質(zhì)（ 3）載體容量（ 4）合適克隆位點（ 5）載體的穩(wěn)定性（ 6）載體 DNA制備的難易（ 7）外源基因表達產(chǎn)物產(chǎn)量、產(chǎn)物特點等2.Tcr為重組子 (AprTcr)用于構(gòu)建 cDNA文庫 顯然 ,+a.克隆位點是確定的（即位于啟動子序列后）；1)1)（ 1） .分別由兩個基因編碼。5） β— 半乳糖苷酶基因（ lacZS亞基上，阻止蛋白質(zhì)合成。Ampicillin可抑制細菌細胞膜上參與細胞壁合成酶類的活性。AAs蛋白質(zhì)，與細菌細胞膜結(jié)合， 阻止四環(huán)素分子進入 細菌細胞。Tetr有的基因是不能用作選擇性標記基因（ lacZ等）。這種指示也可以是 選擇性 的（如 TcS），也可以是 非選擇性的（如 TcS， 1）指示外源 DNA分子（載體或重組分子） 是否進入宿主細胞（三）遺傳標記基因 （二）載體特點 et1. 根據(jù)每個寄主細胞中質(zhì)?？截悢?shù)的多少，把質(zhì)粒分為嚴緊型復制質(zhì)粒（拷貝數(shù)少，為 15個）與松弛型復制質(zhì)粒（拷貝數(shù)多，可達 10200份拷貝）。T4AAGCTT3’T4AHOPAGCT限制酶與其它酶共同作用結(jié)果 1)用途：5’5’引物 5’對 95℃ 高溫具良好穩(wěn)定性，該酶不存在3’→ 5’外切酶活性2.聚合酶活性 4000nt/min其中用途 2)要求 3’ OH引物和模板 DNA，其延續(xù)性受反應條件的影響1）具兩種外切酶活性和 DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，該酶分裂成兩個大小不同的片段，其中小片段具 5’ →3 ’ 外切酶活性，大片段具 3’→5’ 外切酶活性 (大片段亦稱為 Klenow片段 ,2.Ca2+作用于 DNARNA雜交分子中的 RNA鏈，用于 cDNA文庫建立時除去 RNA鏈以便第二條鏈 cDNA鏈的合成。核酸酶 S7， 亦稱微球菌核酸酶，對 RNA敏感，用于除去蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的內(nèi)源 mRNA大部分用于 RNA的核苷酸序列分析或除去 DNA樣品或蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的 RNA分子。339。cExoIII用于順序缺失bc3ac13ac13aRNaseHExoIII的外切酶和 RNaseH的作用1P539。HO339。P539。5.1)4)外切酶活性： 3’→ 5’，產(chǎn)生 5’單磷酸核苷酸和具各種結(jié)構(gòu)的 來自于 ，分子量 28,000BamHI（ GGATmCC） MepI（ mCCGG）GAmATTC— EcoRI(G?AATTC)相同2.AATTC在 DNA重組實驗中，常用的甲基化酶屬于 II型，它與相應的限制酶的識別順序相同，其甲基化位點與限制酶作用位點可同可不同。酶切圖譜的構(gòu)建（ a）請構(gòu)建該環(huán)狀DNA分子的酶切圖譜酶切圖譜的構(gòu)建（ b）二、 DNA甲基化 酶（ 一）、 1.CCCGAG。5’CPyCGPuG3’ｂ）能識別簡并順序的，如： AvaI3’CCTAC(Ｎ )135’SmaI3’CTTAAG5’G3’5’CTGCA2.TN１）識別４ 8個相連的核苷酸命名 ： 限制酶由三部分構(gòu)成，即菌種名、菌系編號、分離順序。3.DNA核酸聚合酶 — 用 于 DNA和 RNA的合成 基因治療人數(shù)情況生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化 — 農(nóng)業(yè)領(lǐng)域已有 35個科 120多種植物獲得轉(zhuǎn)基因植物，一些重要的農(nóng)作物獲得商品化的轉(zhuǎn)基因品種。29產(chǎn)品數(shù)量 410元 /ug巨細胞粒細胞集落刺激因子 開發(fā)成功一個新的生物藥品 ,環(huán)境傳統(tǒng)微生物發(fā)酵、基因工程菌發(fā)酵、動物細胞培養(yǎng)、植物細胞培養(yǎng)發(fā)酵類型： 目標就是通過工程化技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化相應原料成為有用物質(zhì)的技術(shù)。從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組 DNA分子的受體細胞克隆。manipulation)。 基因工程的概念及其主要內(nèi)容第二節(jié) 重組體的篩選第七節(jié) 分子克隆 (molecular二、基因工程的主要內(nèi)容或（步驟）從復雜的生物有機體基因組中，經(jīng)過酶切消化或 PCR擴增等步驟，分離出帶有目的基因的 DNA片段。蛋白質(zhì)工程主要內(nèi)容主要目標液體發(fā)酵、固體發(fā)酵、固定化培養(yǎng)、流式發(fā)酵發(fā)酵技術(shù)設備生物技術(shù)的應用領(lǐng)域醫(yī)藥： 環(huán) 境生物技 術(shù) 重點用于清除危 險廢 棄物 每一步都可能失敗，而前功盡棄高回報 :世界轉(zhuǎn)基因作物大田釋放情況()轉(zhuǎn)基因作物特性 批準項數(shù) 所占比例抗除草劑 1297 %抗蟲 1046 %提高產(chǎn)品質(zhì)量 886 %抗病毒 436 %改善農(nóng)學性狀 211 %抗真菌病 208 %其他 303 %總計 4387 100%轉(zhuǎn)基因作物種植面積生物技術(shù)與傳統(tǒng)中藥中藥現(xiàn)代化 —— 核心是建立與現(xiàn)代基因?qū)W說相應的現(xiàn)代中藥理論現(xiàn)代中藥理論的建立 —— 確立中藥與基因表達的關(guān)系 DNA甲基化酶 — 用 于 DNA分子的甲基化 I型 ： 由三個基因構(gòu)成， hsdR； hsdM； hsdS（hostspecificity）位于染色體上，三個基因構(gòu)成一個復合體，限制酶需要 ATP、Mg2+、 SAM（５ — 腺苷甲硫氨酸），無特異切割位點。上述三個系統(tǒng)中，只有 II型限制酶與甲基化酶具有相當高的核苷酸識別特異性，因而被廣泛用于基因工程中。PuGG(A/T)CCPyN２）富含ＧＣT１） ３ ’端突起 ，個數(shù)為２或４個核苷酸3’CTTAAPHOG5’在進行 DNA重組時，應用限制酶同時切割目的基因和載體 DNA，使之產(chǎn)生相對的粘性末端，然后再將二者連接成重組 DNA分子5’CCCGGG3’3’GGG４）非互補的粘性末端IC定義：能識別相同序列但來源不同的兩種或多種限制 2）切割位點的異同 KpnIGGG限制酶的用途4.具有特異型核苷酸順序識別能力，但該順序不具有對稱結(jié)構(gòu)。4.GACII型甲基化酶對限制酶活性的影響 抑制不同種限制酶的活性順序邊界重疊 抑制不同種限制酶的部分活性2.3)堿基釋放速度： CATG2)HOHOP 539。HO339。P53