基因工程的發(fā)展(已改無錯字)
2023-01-26 17:41:57 本頁面
【正文】 。5’5’3’引物 3’5’復性 5’3’5’3’3’5’引物 3’5’5’3’延伸 5’3’3’5’ 3’5’ 五、連接酶（一）、 T4DNA連接酶1.特點：只連接 dsDNA分子，要求 3’羥基和 5’磷酸基 2.用途：1)相同或相容粘性末端的連接2)平整末端的相連DNA平端來源：限制酶作用結果 。限制酶與其它酶共同作用結果 平端的連接比粘性末端的連接要困難得多，所需的酶量也多5’AAGCTT3’5’AOHPAGCTT3’PAGCTTAOH3’TTCGAA5’3’TTCGAPHOA5’HOATTCGAP 退火5’AHOPAGCTTAHOPAGCTT3’3’TTCGAPOHATTCGAPOHA5’或 5’AHOPAGCTTAHOPAGCTT3’3’TTCGAPOHATTCGAPOHA5’T4DNA連接酶 5’AAGCTTAAGCTT3’3’TTCGAATTCGAA5’或 5’AAGCTTAAGCTT3’3’TTCGAATTCGAA5’T4DNA連接酶的連接反應 (兩種插入方向 ) +第三節(jié) 分子克隆的質粒載體 一、質粒的一般生物學特性；二、質粒 DNA的分離與純化；三、質粒載體的構建及類型；四、常用質粒載體舉例；一、質粒的一般生物學特性（一）、質粒 DNA 質粒 是細菌染色體外能夠自主復制的環(huán)形雙鏈的 DNA分子。編碼抗菌素抗性基因的質粒叫 R質粒 。 R質粒可將其抗性轉移到缺乏該質粒的適宜的受體細胞，使后者也獲得同樣的抗菌素抗性能力。質粒 DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外地游離狀態(tài)，但在一定地條件下又會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體地復制而復制，并通過細胞分裂傳遞到后代。質粒 DNA不僅能在細菌中復制，并且在添加真核復制信號和啟動子后，可以構建出能在原核和真核細胞中均可復制的穿梭質粒，并在真核細胞中表達，因此這類載體在基因工程中應用廣泛。環(huán)形雙鏈的質粒 DNA分子具有三種不同的構型：共價閉合環(huán)狀DNA（ cccDNA），開環(huán) DNA（ ocDNA），線性 DNA（ cDNA），具有不同的電泳遷移率，可在瓊脂糖凝膠電泳中分開 。（二）、質粒的拷貝數(shù)與不親和性 質粒的拷貝數(shù) 是指某種質粒在一個細菌細胞內的數(shù)目。 根據(jù)每個寄主細胞中質粒拷貝數(shù)的多少，把質粒分為嚴緊型復制質粒（拷貝數(shù)少，為 15個）與松弛型復制質粒（拷貝數(shù)多，可達 10200份拷貝）。因此，作為載體的質粒應該是松弛型的。 質粒的不親和性 ，有時也稱為不相容性，是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關系密切的不同質粒，不能夠在同一個寄主細胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。在細胞的增殖構成中，其中必然有一種會被逐漸地排斥（稀釋）掉。這樣的兩種質粒稱為不親和質粒。二、質粒 DNA的分離與純化（放在實驗中講）三、質粒載體的構建及類型（一）質粒載體的發(fā)展概況；（二）質粒載體的特點（基本條件）；（三）遺傳標記基因（四）質粒載體的類型（一）發(fā)展概況1.第一階段（ 1977年前）： 天然質粒和重組質粒的利用，如 pSC101,colE1,pCR,pBR313和 pBR322(1977,Bolivaretal)2.第二階段： 增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點區(qū)和新的遺傳標記基因。如 pUC系列載體。 ： 進一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如 M13mp系列載體，含 T3， T7，sp6啟動子載體，表達型載體及各種探針型載體。 （二）載體特點 至少有一個復制起點，因而至少可在一種生物體中自主復制。 至少應有一個克隆位點，以供外源 DNA插入。 至少應有一個遺傳標記基因，以指示載體或重組 DNA分子是否進入宿主細胞。具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。?注：前三個特點必不可少 。（三）遺傳標記基因 標記基因的作用1）指示外源 DNA分子（載體或重組分子） 是否進入宿主細胞這種指示可以是選擇性的（ Ampr， Tetr， Kanr），也可以是非選擇性的（如 lacZ）2）指示外源 DNA分子 是否插入載體分子 形成了重組子。*這種指示也可以是 選擇性 的（如 TcS），也可以是 非選擇性的（如 TcS， lacZα），絕大多數(shù)為后者。 **有的遺傳標記基因可以完成上述兩項作用。當充任第一作用時，最好是選擇性標記基因；當完成第二作用時，目前多采用非選擇性的 — 檢測性標記基因。有的基因是不能用作選擇性標記基因（ lacZ等）。 標記基因的種類 1
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