【正文】 5’TCGGG。酶GTACC SstI酶切后的末端經(jīng)補(bǔ)平后又可發(fā)生酶切反應(yīng)。限制修飾系統(tǒng) I、 II、 III型中的甲基化酶mATTCC１） 催化反應(yīng)類型3)正式使用前，測定在一定條件下酶的反應(yīng)速度P539。P539。4b24ba339。Mn2+可使酶活達(dá)最大值參與 DNA修復(fù) ,3） 3’→5’ 外切酶活性，可作用于 ssDNA和 dsDNA,制備高比活性探針 (1010特點(diǎn)：3’DNA平端來源：限制酶作用結(jié)果 。 如 pUC系列載體。 Kanr），也可以是非選擇性的（如 lacZ） Apr）Kanamycin， Neomycin和 G418均屬脫氧鏈霉胺氨基葡萄糖苷類抗生素，可結(jié)合在核糖體上阻止蛋白質(zhì)的合成。前者負(fù)責(zé)四聚體裝配，后者具 β— 半乳糖苷酶活性；只有當(dāng)兩者都存在時(shí)，才會(huì)表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為 α互補(bǔ)作用 。酶催化 XGal水解為蘭色產(chǎn)物，檢測直觀c.2)+具有兩種抗菌素抗性基因可供轉(zhuǎn)化子的選擇記號。 其 MCS區(qū)與 M13mp噬菌體載體的相同，可使 pUC上克隆的目的基因直接轉(zhuǎn)移到 M13mp載體，進(jìn)行 DNA測序和體外突變等研究。 不表達(dá) — 表達(dá)型（分泌）載體 4.即為非重組子利用抗生素抗性基因篩選重組子的過程篩選重組子的示意圖 pUC18和 pUC19 pUC系列質(zhì)粒載體具有三個(gè)顯著特點(diǎn)： （ 1）、分子量更小，僅為 ，容納外源 DNA量增大；具有更高的拷貝數(shù)（不用氯霉素?cái)U(kuò)增，每個(gè)細(xì)胞含 500700個(gè)拷貝）。PstI片段 換言之 ,被表達(dá)的外源基因一旦確定 ,重組分子用凝膠電泳檢出（依賴于分子量差異）。a.a.例子 :至少有一個(gè)以上的克隆位點(diǎn)和兩個(gè)標(biāo)記基因，其中一 BamHI片段重組 DNA分子 轉(zhuǎn)化 外源 DNA BamHI片段 涂布在含 XGal和 Ap的平板上 ,白色菌落為重組子， 蘭色菌落 為原載體利用 LacZ基因篩選重組子（四）、質(zhì)粒載體的類型根據(jù)載體的分子生物學(xué)特性劃分 （ 1） .lacZα和 β鏈基因的分別表達(dá)可使載體小而容量大3) 標(biāo)記基因的種類 1） 抗性標(biāo)記基因 （可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子） 主要是 抗生素抗性基因 : Ampr ， Tetr ， Cmlr， Kanr， Strr 2） 生化標(biāo)記基因 質(zhì)粒的不親和性 ，有時(shí)也稱為不相容性，是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象?；? 　　 5’AAGCTT3’TTCGAADNA分子，要求 3’羥基和 5’磷酸基 變性 nt/min,3） 1） 2.同上 PolIP 5’Mg分離自牛胰臟，對熱穩(wěn)定，抗去污劑（ 100℃加熱 15min仍具活性） ,ExoIII [α 32P] [α 32P] dCTP dCTP 539。42b42 OH339。切口 ,1)DNA序列測定時(shí)作順序缺失內(nèi)切酶活性：在無嘌呤或無嘧啶處將 DNA鍵切開， pH１） C不同EcoRI產(chǎn)生粘性末端可以是 15個(gè)核苷酸。限制酶的部分酶切與完全酶切附： IIS型限制酶的特點(diǎn)3.CCGCAsp7185’GAATTC3’末端種類AIinfluensae d定義 ： 廣義指上述三個(gè)系統(tǒng)中的限制酶； restriction眼病 1928如美國 Amgen公司，首次開發(fā)上市的 EPO、 GSCF到 1997年的銷售額分別接近和達(dá)到 20億美元基因工程試劑的高回報(bào)堿性成纖維細(xì)胞生長因子 發(fā)酵工程屬于生物技術(shù)的下游技術(shù)，是工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞、生產(chǎn)生物制品的一種技術(shù)。隨著科學(xué)的發(fā)展，尤其是基因工程技術(shù)的日趨完善，為酶工程賦予了新的內(nèi)容，特別是利用 DNA操作技術(shù)，修飾改造酶分子的結(jié)構(gòu)或活性位點(diǎn)、酶與底物作用位點(diǎn)，重組酶的生產(chǎn)，模擬酶的人工設(shè)計(jì)與合成等成為新的內(nèi)容。DNA基因克隆的質(zhì)粒載體第四節(jié) 基因克隆 (gene三、基因工程技術(shù)及其應(yīng)用轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為生物發(fā)生器基因本身也是一個(gè)產(chǎn)業(yè)Rockfeller蛋白質(zhì)氨基酸序列的分析產(chǎn)品數(shù)量感染性疾病 心臟病 22艾滋病及相關(guān)疾病 移植 由單個(gè)質(zhì)量性狀基因向多基因數(shù)量性狀轉(zhuǎn)變。其它酶類 用于生物細(xì)胞的破壁，轉(zhuǎn)化，核酸純化，檢測等一、限制性內(nèi)切酶（一）、限制修飾系統(tǒng)的種類（二）、限制性內(nèi)切酶的定義、命名（三）、限制酶的特點(diǎn)（四）、異源同序酶（ isoschizomer，同裂酶）（五）、 RIGGCC３）對稱性 — 雙 對稱A３） 三個(gè)系統(tǒng)中的甲基化酶可使細(xì)菌 DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤發(fā)生甲基化，形成 5’甲基胞嘧啶和 6’甲基腺嘌呤。順序完全重疊 P539。HO339。P539。HDNase基因突變時(shí)產(chǎn)生切口 pol補(bǔ)齊 5’突起端切口移位制備探針 與 DNA引物退火 (45℃ )5’3’延伸 2)5’AAGCTT R質(zhì)?？蓪⑵淇剐赞D(zhuǎn)移到缺乏該質(zhì)粒的適宜的受體細(xì)胞，使后者也獲得同樣的抗菌素抗性能力。colE1,至少應(yīng)有一個(gè)克隆位點(diǎn)，以供外源 DNA插入?？敲顾?(Kanr),這兩個(gè)基因（ LacZ和 LacZα）均可作為標(biāo)記基因。b.α2)表達(dá)單元 外源基因表達(dá)終止子（常稱之為表達(dá)分泌型載體）三種表達(dá)型載體結(jié)構(gòu)圖涂布 Tc平板 如常用于基因工程的宿主菌 ，菌株不同，基因型亦不同，不同載體要求不同菌株。 三者均有限制 修飾系統(tǒng)和重組基因缺陷，外源 DNA可存活，且不發(fā)生重組2） TcS為重組子Apr+一般無檢測標(biāo)記基因；基因組或 cDNA文庫的構(gòu)建 。β鏈）互補(bǔ)，產(chǎn)生有活性的 β— 半乳糖苷酶，在含有指示劑 Xgal和誘導(dǎo)劑 IPTG的存在下，菌落呈現(xiàn)蘭色；外源基因的插入后，破壞了 lacZTetracycline2）指示外源 DNA分子 是否插入載體分子 形成了重組子。至少應(yīng)有一個(gè)遺傳標(biāo)記基因，以指示載體或重組 DNA分子是否進(jìn)入宿主細(xì)胞。pBR313和 pBR322質(zhì)粒 DNA不僅能在細(xì)菌中復(fù)制，并且在添加真核復(fù)制信號和啟動(dòng)子后，可以構(gòu)建出能在原核和真核細(xì)胞中均可復(fù)制的穿梭質(zhì)粒，并在真核細(xì)胞中表達(dá)，因此這類載體在基因工程中應(yīng)用廣泛。TCGAPOHA5’3’T退火HOAHOA5’PAGCTT復(fù)性 引物延伸 (75℃) Taq2.用途 Mg++存在時(shí) DNaseI作用特點(diǎn)DNaseI特點(diǎn)： 具內(nèi)切酶活性，作用于 ds1.HOP539。HO339。HO2)堿基釋放速度： CATG抑制不同種限制酶的部分活性II型甲基化酶對限制酶活性的影響 C4.具有特異型核苷酸順序識別能力，但該順序不具有對稱結(jié)構(gòu)。4