【正文】 992)氯霉素抗性基因 （ Chlorophenicol可結(jié)合在核糖體 50卡那霉素 (Kanr),Kanr等 抗性基因均可使這類抗生素 磷酸化 ，使之不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。β— 半乳糖苷酶基因有 1021這兩個(gè)部分可獨(dú)立存在， 這兩個(gè)基因（ LacZ和 LacZα）均可作為標(biāo)記基因。β— 半乳糖苷酶基因的優(yōu)點(diǎn) :b.PαβLacZ基因的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)物pUC18 質(zhì)粒型載體 — 環(huán)狀 dsDNA分子，自主復(fù)制 （ 2） .個(gè)用于轉(zhuǎn)化體選擇，另一個(gè)用于重組子檢測。2)pBR322和 pUC載體?；虻膯?dòng)子序列和終止子序列；結(jié)構(gòu) :表達(dá)單元 外源基因表達(dá)類型 :終止子翻譯起始區(qū) 終止子（常稱之為表達(dá)分泌型載體）三種表達(dá)型載體結(jié)構(gòu)圖表達(dá)載體的類型也就確定了。b.具有較高的拷貝數(shù)，經(jīng)過氯霉素?cái)U(kuò)增后，每個(gè)細(xì)胞中可累積 10003000個(gè)拷貝，為重組體 DNA的制備提供了極大的方便。重組分子 I 重組分子 Ⅱ (Aps外源 DNABamHI片段重組分子 IApr轉(zhuǎn)化子 分別轉(zhuǎn)化 (ApS涂布 Tc平板 ApS （ 2）、含易于檢測是否有外源 DNA插入的標(biāo)記基因 LacZα ，可利用 ?互補(bǔ)原理進(jìn)行藍(lán)白篩選。pUC18和 pUC19載體利用菌落顏色篩選重組子分子克隆載體的選擇1.如常用于基因工程的宿主菌 ，菌株不同，基因型亦不同，不同載體要求不同菌株。DH5αF’ 可供 M13mp系列載體配套使用， M13病毒的感染需要 F’ 的存在3. 載體容量 M13mp載體 4 kb 細(xì)菌質(zhì)粒載體 10kb λ 載體 23kb cos質(zhì)粒載體 48kb P1載體 95 kb pYAC載體 ∽1000 kb5.不表達(dá)，選表達(dá)載體 (外源基因必須表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物必須具備活性 ) ⅱ) 免疫法：與上同，但表達(dá)產(chǎn)物不一定具生物活性 ⅲ) 雜交法：各種載體均可2) 目的基因的鑒定 次克隆：選用質(zhì)粒載體，限制酶譜分析，基因結(jié)構(gòu)分析等 定序：定序載體（ M13mp系列），其他質(zhì)粒載體（如 pUC系列，pBR322， T3， T7， SP6啟動(dòng)子載體）3) 基因表達(dá)與調(diào)控 外源基因可表達(dá) — 普通載體 。 三者均有限制 修飾系統(tǒng)和重組基因缺陷，外源 DNA可存活，且不發(fā)生重組2） 實(shí)驗(yàn)對象（ 1）供體：遺傳背景與 DNA特點(diǎn)等，其中包括染色體 DNA大小，基因大小與結(jié)構(gòu)，堿基組成，目的基因的產(chǎn)物特點(diǎn)以及遺傳物質(zhì)的傳遞方式等。每一種限制性內(nèi)切酶會(huì)產(chǎn)生不同的粘性末端，可選用兩種內(nèi)切酶組合在質(zhì)粒載體和外源 DNA上產(chǎn)生相同的末端，進(jìn)行雙粘端連接，既提高克隆的效率，又可以定向克隆。TcS為重組子AprTcr轉(zhuǎn)化子影印到 Tc平板上 重組分子 Ⅱ Tcs）BamHI片段 (Tcr)四、常用質(zhì)粒載體舉例 pBR322載體 pUC載體 pBR322載體優(yōu)點(diǎn)：分子量較小，為 4363bp，不僅利于自身 DNA的純化，可容納的外源 DNA也較大。表達(dá)外源基因以產(chǎn)生大量外源基因產(chǎn)物4)不同類型載體中所缺少的部分必須由外源基因提供。信號肽鏈編碼區(qū) 轉(zhuǎn)錄起始區(qū) +終止子轉(zhuǎn)化單元 宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化d.一般無檢測標(biāo)記基因；特點(diǎn) :vector）上述兩例中的非重組子來源有兩個(gè)：基因組或 cDNA文庫的構(gòu)建 。特點(diǎn) :普通型載體LacZβLacZαc.a.β鏈）互補(bǔ)，產(chǎn)生有活性的 β— 半乳糖苷酶，在含有指示劑 Xgal和誘導(dǎo)劑 IPTG的存在下，菌落呈現(xiàn)蘭色；外源基因的插入后，破壞了 lacZ為 α鏈編碼的基因稱之為lacZα(編碼 145該蛋白質(zhì)可分為兩部分： α鏈和 β鏈。和 lacZα） Cmr基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，使氯霉素 乙?；?，導(dǎo)致乙?；穆让顾夭荒芙Y(jié)合在核糖體上。 Cmr） Apr抗性基因編碼一種分泌到細(xì)菌細(xì)胞周間質(zhì)的酶，可特異地 切割 氨芐青霉素的 β— 內(nèi)酰胺環(huán)，使氨芐青霉素失活。AmprTetracycline Tcr） lacZα），絕大多數(shù)為后者。2）指示外源 DNA分子 是否插入載體分子 形成了重組子。 Tetr標(biāo)記基因的作用至少應(yīng)有一個(gè)遺傳標(biāo)記基因，以指示載體或重組 DNA分子是否進(jìn)入宿主細(xì)胞。至少有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，因而至少可在一種生物體中自主復(fù)制。第二階段： 增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。al)pBR313和 pBR322二、質(zhì)粒 DNA的分離與純化（放在實(shí)驗(yàn)中講）三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建及類型（一）質(zhì)粒載體的發(fā)展概況；（二）質(zhì)粒載體的特點(diǎn)（基本條件）；（三）遺傳標(biāo)記基因（四）質(zhì)粒載體的類型（一）發(fā)展概況因此，作為載體的質(zhì)粒應(yīng)該是松弛型的。質(zhì)粒 DNA不僅能在細(xì)菌中復(fù)制，并且在添加真核復(fù)制信號和啟動(dòng)子后，可以構(gòu)建出能在原核和真核細(xì)胞中均可復(fù)制的穿梭質(zhì)粒，并在真核細(xì)胞中表達(dá)，因此這類載體在基因工程中應(yīng)用廣泛。DNA連接酶的連接反應(yīng) (兩種插入方向 ) +第三節(jié) 分子克隆的質(zhì)粒載體 一、質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性；二、質(zhì)粒 DNA的分離與純化；三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建及類型；四、常用質(zhì)粒載體舉例；一、質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性（一）、質(zhì)粒 DNA 質(zhì)粒 是細(xì)菌染色體外能夠自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈的 DNA分子。DNA連接酶　　　　　　 TCGAPOHA5’3’TT或 TCGAPOHA5’3’TT退火HOAHOA5’PAGCTT平端的連接比粘性末端的連接要困難得多，所需的酶量也多相同或相容粘性末端的連接只連接 ds特點(diǎn)： 3’3’5’引物 復(fù)性 5’3’引物延伸 (75℃) TaqDNA擴(kuò)增技術(shù)又稱為 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) ，它包括以下三個(gè)步驟：主要用于 DNA的體外擴(kuò)增，經(jīng) 25次循環(huán)后才進(jìn)入酶的反應(yīng)穩(wěn)定期，一個(gè) DNA用途：DNA聚合酶1.無 dNTPDNA末端修飾 缺失2.5’ →3 ’ 聚合酶活性， 15001.和 3)常用大片段（二）、 用途 polIK)3’DNaseI與Pol Mg++存在時(shí) DNaseI作用特點(diǎn)DNaseI制備 RNA樣品時(shí)除去 DNA分子用途2+存在時(shí)，兩條鏈上的切口獨(dú)立無關(guān)， Mn2+存在時(shí)，兩條鏈上的切口幾乎在同一位置,特點(diǎn)： 具內(nèi)切酶活性，作用于 ds 1.HOOH339。PP539。ExoIII ca3HOP539。P539。P539。HOOH339。HO339。P339。P 539。HOHO在一定條件下， ExoIII不能作用 GC富集區(qū) (來自于 cDNA加尾 )dsDN