【正文】 AGE、蛋白質(zhì)組等技術(shù)）以及相關(guān)信息數(shù)據(jù)庫(kù)的建立采用的基因正在從抗除草劑、抗菌素、抗病蟲(chóng)害基因到抗逆境、高品質(zhì)方向發(fā)展。腫瘤疾病 骨質(zhì)疏松 眼病 糖尿病及并發(fā)癥 1119自主免疫系統(tǒng)疾病 192839231元 /ug紅細(xì)胞生成素 如美國(guó) Amgen公司，首次開(kāi)發(fā)上市的 EPO、 GSCF到 1997年的銷售額分別接近和達(dá)到 20億美元基因工程試劑的高回報(bào)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 新型食品；營(yíng)養(yǎng)食品；保健食品；輕工用酶 生物反應(yīng)器 ：利用動(dòng)植物細(xì)胞或組織作為生物反應(yīng)器，直接生產(chǎn)有用蛋白質(zhì)輕工與食品轉(zhuǎn)基因植物 ：抗病蟲(chóng)害新品種、抗逆新品種、 生物制藥；基因治療；人工器官農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)傳統(tǒng)的發(fā)酵工程主要用于微生物。發(fā)酵工程屬于生物技術(shù)的下游技術(shù)，是工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞、生產(chǎn)生物制品的一種技術(shù)。隨著科學(xué)的發(fā)展，尤其是基因工程技術(shù)的日趨完善，為酶工程賦予了新的內(nèi)容，特別是利用 DNA操作技術(shù)，修飾改造酶分子的結(jié)構(gòu)或活性位點(diǎn)、酶與底物作用位點(diǎn)，重組酶的生產(chǎn)，模擬酶的人工設(shè)計(jì)與合成等成為新的內(nèi)容。將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。在體外，將帶有目的基因的外源 DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號(hào)的載體分子上，形成重組 DNA分子。DNAcloning)。engineering)。目的基因的表達(dá)第一節(jié) 基因工程的概念及其主要內(nèi)容一、基因工程的概念：基因克隆的質(zhì)粒載體第四節(jié) 基因工程的發(fā)展第一節(jié) 目的基因的分離第五節(jié) 基因克隆 (gene基因操作 (genetechnique)克隆 (clone):將重組 DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞 (亦稱寄主細(xì)胞 )，并與之一起增殖。三、基因工程技術(shù)及其應(yīng)用轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為生物發(fā)生器基因本身也是一個(gè)產(chǎn)業(yè)Rockfeller蛋白質(zhì)氨基酸序列的分析蛋白質(zhì)組分析酶工程的概念是酶學(xué)與工程學(xué)的相互滲透和結(jié)合所發(fā)展起來(lái)以酶為研究對(duì)象，改造并應(yīng)用酶的特異催化功能。 酶工程的主要內(nèi)容酶的分離純化酶與細(xì)胞的固定化技術(shù)及反應(yīng)器酶制劑的發(fā)酵生產(chǎn)酶分子化學(xué)修飾、遺傳突變及結(jié)構(gòu)改造酶抑制劑與激活劑開(kāi)發(fā)與研究人工設(shè)計(jì)與合成模擬酶及酶分子發(fā)酵工程概念現(xiàn)代生物技術(shù)還包括動(dòng)物、植物細(xì)胞和工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵工程技術(shù)發(fā)酵對(duì)象：高品質(zhì)新品種 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 ：生產(chǎn)有用蛋白質(zhì)和高品質(zhì)的畜產(chǎn)品 /mg美國(guó)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展情況 美國(guó)生物制藥產(chǎn)品種類及數(shù)量（ PHRAM）疾病種類 疾病種類 產(chǎn)品數(shù)量感染性疾病 心臟病 26神經(jīng)系統(tǒng)疾病 呼吸系統(tǒng)疾病 22艾滋病及相關(guān)疾病 19皮膚病 移植 13消化系統(tǒng)疾病 11血液疾病 7不育癥 3生長(zhǎng)發(fā)育不良癥 2妊娠預(yù)防 175由單個(gè)質(zhì)量性狀基因向多基因數(shù)量性狀轉(zhuǎn)變。中藥藥靶 （基因）或作用位點(diǎn)基因的尋找中藥臨床藥效 的科學(xué)評(píng)價(jià)與分析方法生物技術(shù)的應(yīng)用中藥新劑型第二節(jié) 基因工程中的工具酶限制性內(nèi)切酶 — 主 要用于 DNA分子的特異切割 核酸酶 — 用 于 DNA和 RNA的非特異性切割 其它酶類 用于生物細(xì)胞的破壁，轉(zhuǎn)化，核酸純化，檢測(cè)等一、限制性內(nèi)切酶（一）、限制修飾系統(tǒng)的種類（二）、限制性內(nèi)切酶的定義、命名（三）、限制酶的特點(diǎn)（四）、異源同序酶（ isoschizomer，同裂酶）（五）、 formodificationII型 ： 限制與修飾基因產(chǎn)物獨(dú)立起作用，在 Ｅ . coli中這兩種基因位于質(zhì)粒上。狹義指 II型限制酶。2.RIⅢSacI(Ⅱ )（三）、限制酶的特點(diǎn)GGATCC： PpuMIGGCCNCCGGN’N’N’N’N’CCGGI外側(cè)，產(chǎn)生５ ’端突起３）對(duì)稱性 — 雙 對(duì)稱A3’CA４）切點(diǎn)大多數(shù)在識(shí)別順序之內(nèi)，也有例外EcoRI5’GOHPAATTC3’３） 5’CCC3’GGGCCC5’5’GGATG(Ｎ )93’5’GGATG(N)93’CCTAC(N)13CCCGGG。GGTACSacIGG2.突變分析（ RFLP分析）kD 。三個(gè)系統(tǒng)中的甲基化酶可使細(xì)菌 DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤發(fā)生甲基化，形成 5’甲基胞嘧啶和 6’甲基腺嘌呤。GHpaICGG抑制同種限制酶的活性 順序完全重疊 ClaI（ ATCGmAT） TaqI（ TCGmA）如： M.改變某些限制酶識(shí)別順序的特異性，以便重組體的形成一般特點(diǎn)： 3’磷酸酶活性：除去 3’磷酸基后形成 3’OH端，有利于 DNA聚合酶反應(yīng)， pH3.1)反應(yīng)產(chǎn)物： 5’單磷酸核苷和具缺口或 5’端突起的dsDNA，過(guò)度反應(yīng)將導(dǎo)致 DNA降解2)基因突變 缺失缺口 ,切口 (nick)P539。P539。P 539。HO339。HO339。OH339。 P539。P539。P539。24bPP539。HOOH339。A用于除去 DNA樣品中的 RNA分子2.HDNase2+當(dāng)酶濃度很低時(shí)， ds切口移位，制備 DNA探針基因突變時(shí)產(chǎn)生切口 3’5’的切口移位 Pol1.I具 3’→5’ 和 5’ →3 ’ 外切酶活性IIpol具 3’→5’ 和 5’ →3 ’ 外切酶活性聚合酶活性， 5’ →3 ’ ,外切酶活性 除去 3’端突起的單鏈 DNA（在無(wú) dNTP時(shí)）補(bǔ)齊 5’突起端合成第二條 cDNA切口移位制備探針 T4為 pol其切除速度分別為 40和 cpm/μgDNA)。分離自水生棲熱菌，分子量為 94,000，最適反應(yīng)溫度 75℃ ， 與 DNA引物退火 (45℃ )和 PCR 3’5’5’3’3’3’延伸 3’5’ 五、連接酶（一）、 T41.2.2)PAGCTT3’5’AHOPAGCTT3’TCGAPOHA5’AHOPAGCTT3’TCGAPOHA5’AAGCTTTTCGAA5’AAGCTT3’TTCGAA5’ R質(zhì)?？蓪⑵淇剐赞D(zhuǎn)移到缺乏該質(zhì)粒的適宜的受體細(xì)胞，使后者也獲得同樣的抗菌素抗性能力。（二）、質(zhì)粒的拷貝數(shù)與不親和性 質(zhì)粒的拷貝數(shù) 是指某種質(zhì)粒在一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的數(shù)目。在細(xì)胞的增殖構(gòu)成中，其中必然有一種會(huì)被逐漸地排斥（稀釋）掉。colE1,Bolivar2. ： 進(jìn)一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如 M13mp系列載體，含 T3， T7，sp6啟動(dòng)子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。至少應(yīng)有一個(gè)克隆位點(diǎn)，以供外源 DNA插入。?注：前三個(gè)特點(diǎn)必不可少 。*當(dāng)充任第一作用時(shí)，最好是選擇性標(biāo)記基因；當(dāng)完成第二作用時(shí)，目前多采用非選擇性的 — 檢測(cè)性標(biāo)記基因。四環(huán)素抗性基因 （ 四環(huán)素抗性基因編碼一種 3