【正文】 以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外地游離狀態(tài)，但在一定地條件下又會(huì)可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體地復(fù)制而復(fù)制，并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代。環(huán)形雙鏈的質(zhì)粒 DNA分子具有三種不同的構(gòu)型：共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（ cccDNA），開環(huán) DNA（ ocDNA），線性 DNA（ cDNA），具有不同的電泳遷移率，可在瓊脂糖凝膠電泳中分開 。 根據(jù)每個(gè)寄主細(xì)胞中質(zhì)?？截悢?shù)的多少，把質(zhì)粒分為嚴(yán)緊型復(fù)制質(zhì)粒（拷貝數(shù)少，為 15個(gè)）與松弛型復(fù)制質(zhì)粒（拷貝數(shù)多，可達(dá) 10200份拷貝）。 質(zhì)粒的不親和性 ，有時(shí)也稱為不相容性，是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。這樣的兩種質(zhì)粒稱為不親和質(zhì)粒。1.第一階段（ 1977年前）： 天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如 pSC101,pCR,(1977,et如 pUC系列載體。 （二）載體特點(diǎn) 具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。（三）遺傳標(biāo)記基因 1）指示外源 DNA分子（載體或重組分子） 是否進(jìn)入宿主細(xì)胞這種指示可以是選擇性的（ Ampr Kanr），也可以是非選擇性的（如 lacZ）這種指示也可以是 選擇性 的（如 TcS），也可以是 非選擇性的（如 TcS， **有的遺傳標(biāo)記基因可以完成上述兩項(xiàng)作用。有的基因是不能用作選擇性標(biāo)記基因（ lacZ等）。 標(biāo)記基因的種類 1） 抗性標(biāo)記基因 （可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子） 主要是 抗生素抗性基因 : Ampr ， Tetr ， Cmlr， Kanr， Strr 2） 生化標(biāo)記基因其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測(cè)的生化反應(yīng)，如 lacZ常用的遺傳標(biāo)記基因及其作用機(jī)制1)Tetr可結(jié)合在核糖體 30s亞基中的一種蛋白質(zhì)分子上，抑制核糖體的轉(zhuǎn)位過程。AAs蛋白質(zhì)，與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合， 阻止四環(huán)素分子進(jìn)入 細(xì)菌細(xì)胞。氨芐青霉素抗性基因 （ Apr）Ampicillin可抑制細(xì)菌細(xì)胞膜上參與細(xì)胞壁合成酶類的活性。3)CmlrS亞基上，阻止蛋白質(zhì)合成。4)新霉素 (Neor)和 G418抗性 (G418r)基因Kanamycin， Neomycin和 G418均屬脫氧鏈霉胺氨基葡萄糖苷類抗生素，可結(jié)合在核糖體上阻止蛋白質(zhì)的合成。5） β— 半乳糖苷酶基因（ lacZAAs，基因產(chǎn)物裝配為四聚體后才有酶活。前者負(fù)責(zé)四聚體裝配，后者具 β— 半乳糖苷酶活性；只有當(dāng)兩者都存在時(shí)，才會(huì)表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為 α互補(bǔ)作用 。分別由兩個(gè)基因編碼。AAs)。 lacZ（ lacZα）中含有多克隆位點(diǎn)，當(dāng)無外源 DNA片段插入時(shí)，質(zhì)粒表達(dá) β— 半乳糖苷酶的 α肽，與缺失突變體宿主菌（不能編碼 α肽）表達(dá)的 lacZ基因產(chǎn)物（ α肽基因的結(jié)構(gòu)，細(xì)菌內(nèi)不能產(chǎn)生 β— 半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。酶催化 XGal水解為蘭色產(chǎn)物，檢測(cè)直觀lacZα編碼 5‘端可容許很大的變化（如加入多克隆位點(diǎn)）而不影響酶活性lacZα和 β鏈基因的分別表達(dá)可使載體小而容量大轉(zhuǎn)錄 翻譯 BamHI片段重組 DNA分子 轉(zhuǎn)化 外源 DNA BamHI片段 涂布在含 XGal和 Ap的平板上 ,白色菌落為重組子， 蘭色菌落 為原載體利用 LacZ基因篩選重組子（四）、質(zhì)粒載體的類型根據(jù)載體的分子生物學(xué)特性劃分 （ 1） . 病毒型載體 — 環(huán)狀、線狀、 ss和 dsDNA分子，形成病毒顆粒 （ 3） .混合型載體 — 具質(zhì)粒和病毒特性，特性的轉(zhuǎn)換依賴于宿主細(xì)胞生物學(xué)特性 根據(jù)載體功能劃分（ 1） .1)至少有一個(gè)以上的克隆位點(diǎn)和兩個(gè)標(biāo)記基因，其中一 用途 :次克隆 (subcloning)或限制酶譜分析；外源 DNA擴(kuò)增。例子 :a.酶切反應(yīng)時(shí)仍未被作用的 pBR322或 pUC18分子 b. 酶切后的載體分子經(jīng)自我連接又形成載體分子普通型載體 pBR322的結(jié)構(gòu)圖pUC18和 pUC19載體（ 2）、表達(dá)型載體（ expression1)a.b.c.克隆位點(diǎn)是確定的（即位于啟動(dòng)子序列后）；重組分子用凝膠電泳檢出（依賴于分子量差異）。2)a.b.3)Ⅰ 型 ：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)（調(diào)控序列 +啟動(dòng)子） +Ⅱ 型 :轉(zhuǎn)錄起始區(qū)終止子 翻譯起始區(qū)（核糖體結(jié)合序列和起始密碼子） +Ⅲ 型 :+++顯然 ,換言之 ,被表達(dá)的外源基因一旦確定 ,用途 :a.用于構(gòu)建 cDNA文庫 具有兩種抗菌素抗性基因可供轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)。pBR322PstI(Apr)片段 Tcr)(AprPstI片段 涂布 Ap平板 TcS)AprTcr為原載體 影印到 Ap平板上 Tcr為重組子 即為非重組子利用抗生素抗性基因篩選重組子的過程篩選重組子的示意圖 pUC18和 pUC19 pUC系列質(zhì)粒載體具有三個(gè)顯著特點(diǎn)： （ 1）、分子量更小，僅為 ，容納外源 DNA量增大；具有更高的拷貝數(shù)（不用氯霉素?cái)U(kuò)增，每個(gè)細(xì)胞含 500700個(gè)拷貝）。 （ 3）、多克隆位點(diǎn)區(qū)（ MCS） 由人工合成的多個(gè)單一酶切位點(diǎn)構(gòu)成。 其 MCS區(qū)與 M13mp噬菌體載體的相同，可使 pUC上克隆的目的基因直接轉(zhuǎn)移到 M13mp載體，進(jìn)行 DNA測(cè)序和體外突變等研究。選擇克隆載體的幾個(gè)重要參數(shù)（ 1）實(shí)驗(yàn)對(duì)象 （ 2）實(shí)驗(yàn)性質(zhì)（ 3）載體容量（ 4）合適克隆位點(diǎn)（ 5）載體的穩(wěn)定性（ 6）載體 DNA制備的難易（ 7）外源基因表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量、產(chǎn)物特點(diǎn)等2.（ 2）受體：各種中間宿主與終宿主的遺傳背景，如遺傳物質(zhì)的傳遞方式 (包括人為的方法 )， DNA限制修飾系統(tǒng)， DNA重組基因特點(diǎn)，基因產(chǎn)物修飾系統(tǒng)，即轉(zhuǎn)錄與翻譯后修飾系統(tǒng)。如： DH DH5α 、 E .coliDH5αF’ 1） DH5α 和 DH5αF’ 都具有一個(gè)可供遺傳標(biāo)記 lacZα 檢測(cè)的遺傳背景3） 實(shí)驗(yàn)性質(zhì)分子克隆的一般程序包括以下幾步： （ 1）分離供體 DNA或 RNA（ mRNA）和載體 DNA （ 2）構(gòu)建基因文庫或 cDNA文庫 （ 3）目的基因或 cDNA 克隆的篩選 （ 4）目的基因或 cDNA片段的鑒定：限制酶譜，次克隆，核苷酸序列分析，基因結(jié)構(gòu)分析等 （ 5）基因表達(dá)與調(diào)控機(jī)理的研究1) 建立文庫用載體 常在 進(jìn)行 小 — 質(zhì)粒載體，操作方便，鑒定簡(jiǎn)單 大 —λ 或 cos質(zhì)粒載體 , 甚至 pYAC載體 (為減少文庫規(guī)模，即使基因組小的也可用 λ 和 cos載體） ⅰ) 互補(bǔ)法：可表達(dá) ,選一般載體 。 不表達(dá) — 表達(dá)型（分泌）載體 4. 合適的克隆位點(diǎn) 單克隆位點(diǎn)和多克隆位點(diǎn)演講完畢，謝謝觀看！