【正文】 ） 抗性標(biāo)記基因 （可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子） 主要是 抗生素抗性基因 : Ampr ， Tetr ， Cmlr， Kanr， Strr 2） 生化標(biāo)記基因其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測(cè)的生化反應(yīng)，如 lacZ常用的遺傳標(biāo)記基因及其作用機(jī)制1)四環(huán)素抗性基因 （ Tetr， Tcr）Tetracycline可結(jié)合在核糖體 30s亞基中的一種蛋白質(zhì)分子上，抑制核糖體的轉(zhuǎn)位過程。四環(huán)素抗性基因編碼一種 399AAs蛋白質(zhì)，與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合， 阻止四環(huán)素分子進(jìn)入 細(xì)菌細(xì)胞。2)氨芐青霉素抗性基因 （ Ampr， Apr）Ampicillin可抑制細(xì)菌細(xì)胞膜上參與細(xì)胞壁合成酶類的活性。 Apr抗性基因編碼一種分泌到細(xì)菌細(xì)胞周間質(zhì)的酶，可特異地 切割 氨芐青霉素的 β— 內(nèi)酰胺環(huán)，使氨芐青霉素失活。3)氯霉素抗性基因 （ Cmlr， Cmr） Chlorophenicol可結(jié)合在核糖體 50S亞基上，阻止蛋白質(zhì)合成。 Cmr基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，使氯霉素 乙?；?，導(dǎo)致乙酰化的氯霉素不能結(jié)合在核糖體上。4)卡那霉素 (Kanr),新霉素 (Neor)和 G418抗性 (G418r)基因Kanamycin， Neomycin和 G418均屬脫氧鏈霉胺氨基葡萄糖苷類抗生素，可結(jié)合在核糖體上阻止蛋白質(zhì)的合成。Kanr等 抗性基因均可使這類抗生素 磷酸化 ，使之不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。5） β— 半乳糖苷酶基因（ lacZ和 lacZα）β— 半乳糖苷酶基因有 1021AAs，基因產(chǎn)物裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質(zhì)可分為兩部分： α鏈和 β鏈。前者負(fù)責(zé)四聚體裝配，后者具 β— 半乳糖苷酶活性；只有當(dāng)兩者都存在時(shí)，才會(huì)表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為 α互補(bǔ)作用 。這兩個(gè)部分可獨(dú)立存在， 分別由兩個(gè)基因編碼。為 α鏈編碼的基因稱之為lacZα(編碼 145AAs)。這兩個(gè)基因（ LacZ和 LacZα）均可作為標(biāo)記基因。 lacZ（ lacZα）中含有多克隆位點(diǎn)，當(dāng)無外源 DNA片段插入時(shí)，質(zhì)粒表達(dá) β— 半乳糖苷酶的 α肽，與缺失突變體宿主菌（不能編碼 α肽）表達(dá)的 lacZ基因產(chǎn)物（ β鏈）互補(bǔ)，產(chǎn)生有活性的 β— 半乳糖苷酶，在含有指示劑 Xgal和誘導(dǎo)劑 IPTG的存在下，菌落呈現(xiàn)蘭色；外源基因的插入后，破壞了 lacZα肽基因的結(jié)構(gòu)，細(xì)菌內(nèi)不能產(chǎn)生 β— 半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。β— 半乳糖苷酶基因的優(yōu)點(diǎn) :a.酶催化 XGal水解為蘭色產(chǎn)物，檢測(cè)直觀b.lacZα編碼 5‘端可容許很大的變化（如加入多克隆位點(diǎn)）而不影響酶活性c.lacZα和 β鏈基因的分別表達(dá)可使載體小而容量大PLacZαLacZβ轉(zhuǎn)錄 翻譯 αβLacZ基因的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)物pUC18BamHI片段重組 DNA分子 轉(zhuǎn)化 外源 DNA BamHI片段 涂布在含 XGal和 Ap的平板上 ,白色菌落為重組子， 蘭色菌落 為原載體利用 LacZ基因篩選重組子（四）、質(zhì)粒載體的類型根據(jù)載體的分子生物學(xué)特性劃分 （ 1） . 質(zhì)粒型載體 — 環(huán)狀 dsDNA分子，自主復(fù)制 （ 2） . 病毒型載體 — 環(huán)狀、線狀、 ss和 dsDNA分子，形成病毒顆粒 （ 3） .混合型載體 — 具質(zhì)粒和病毒特性，特性的轉(zhuǎn)換依賴于宿主細(xì)胞生物學(xué)特性 根據(jù)載體功能劃分（ 1） .普通型載體1)特點(diǎn) :至少有一個(gè)以上的克隆位點(diǎn)和兩個(gè)標(biāo)記基因，其中一 個(gè)用于轉(zhuǎn)化體選擇，另一個(gè)用于重組子檢測(cè)。2)用途 :基因組或 cDNA文庫的構(gòu)建 。次克隆 (subcloning)或限制酶譜分析；外源 DNA擴(kuò)增。例子 :pBR322和 pUC載體。上述兩例中的非重組子來源有兩個(gè)：a.酶切反應(yīng)時(shí)仍未被作用的 pBR322或 pUC18分子 b. 酶切后的載體分子經(jīng)自我連接又形成載體分子普通型載體 pBR322的結(jié)構(gòu)圖pUC18和 pUC19載體（ 2）、表達(dá)型載體（ expressionvector）1)特點(diǎn) :a.基因的啟動(dòng)子序列和終止子序列；b.一般無檢測(cè)標(biāo)記基因；c.克隆位點(diǎn)是確定的（即位于啟動(dòng)子序列后）；d.重組分子用凝膠電泳檢出（依賴于分子量差異）。2)結(jié)構(gòu) :a.轉(zhuǎn)化單元 宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化b.表達(dá)單元 外源基因表達(dá)3)類型 :Ⅰ 型 ：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)（調(diào)控序列 +啟動(dòng)子） +終止子Ⅱ 型 :轉(zhuǎn)錄起始區(qū)終止子 +翻譯起始區(qū)（核糖體結(jié)合序列和起始密碼子） +終止子Ⅲ 型 :轉(zhuǎn)錄起始區(qū) +翻譯起始區(qū) +信號(hào)肽鏈編碼區(qū) +終止子（常稱之為表達(dá)分泌型載體）三種表達(dá)型載體結(jié)構(gòu)圖顯然 ,不同類型載體中所缺少的部分必須由外源基因提供。換言之 ,被表達(dá)的外源基因一旦確定 ,表達(dá)載體的類型也就確定了。4)用途 :a.表達(dá)外源基因以產(chǎn)生大量外源基因產(chǎn)物b.用于構(gòu)建 cDNA文庫 四、常用質(zhì)粒載體舉例 pBR322載體 pUC載體 pBR322載體優(yōu)點(diǎn)：分子量較小，為 4363bp，不僅利于自身 DNA的純化，可容納的外源 DNA也較大。具有兩種抗菌素抗性基因可供轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)。具有較高的拷貝數(shù)，經(jīng)過氯霉素?cái)U(kuò)增后，每個(gè)細(xì)胞中可累積 10003000個(gè)拷貝，為重組體 DNA的制備提供了極大的方便。BamHI片段 (Tcr)pBR322PstI(Apr)片段 重組分子 I 重組分子 Ⅱ (ApsTcr)(AprTcs）PstI片段 外源 DNABamHI片段重組分子 I涂布 Ap平板 Apr轉(zhuǎn)化子 分別轉(zhuǎn)化 (ApSTcS)重組分子 Ⅱ 涂布 Tc平板 Tcr轉(zhuǎn)化子影印到 Tc平板上 AprTcS為重組子AprTcr為原載體 影印到 Ap平板上 ApSTcr為重組子 即為非重組子利用抗生素抗性基因篩選重組子的過程篩選重組子的示意圖 pUC18和 pUC19 pUC系列質(zhì)粒載體具有三個(gè)顯著特點(diǎn)： （ 1）、分子量更小，僅為 ，容納外源 DNA量增大；具有更高的拷貝數(shù)（不用氯霉素?cái)U(kuò)增，每個(gè)細(xì)胞含 500700個(gè)拷貝）。 （ 2）、含易于檢測(cè)是否有外源 DNA插入的標(biāo)記基因 LacZα ，可利用 ?互補(bǔ)原理進(jìn)行藍(lán)白篩選。 （ 3）、多克隆位點(diǎn)區(qū)（ MCS） 由人工合成的多個(gè)單一酶切位點(diǎn)構(gòu)成。每一種限制性內(nèi)切酶會(huì)產(chǎn)生不同的粘性末端，可選用兩種內(nèi)切酶組合在質(zhì)粒載體和外源 DNA上產(chǎn)生相同的末端，進(jìn)行雙粘端連接，既提高克隆的效率，又可以定向克隆。 其 MCS區(qū)與 M13mp噬菌體載體的相同，可使 pUC上克隆的目的基因直接轉(zhuǎn)移到 M13mp載體，進(jìn)行 DNA測(cè)序和體外突變等研究。pUC18和 pUC19載體利用菌落顏色篩選重組子分子克隆載體的選擇1.選擇克隆載體的幾個(gè)重要參數(shù)（ 1）實(shí)驗(yàn)對(duì)象 （ 2）實(shí)驗(yàn)性質(zhì)（ 3）載體容量（ 4）合適克隆位點(diǎn)（ 5）載體的穩(wěn)定性（ 6）載體 DNA制備的難易（ 7）外源基因表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量、產(chǎn)物特點(diǎn)等2.實(shí)驗(yàn)對(duì)象（ 1）供體：遺傳背景與 DNA特點(diǎn)等，其中包括染色體 DNA大小，基因大小與結(jié)構(gòu)，堿基組成，目的基因的產(chǎn)物特點(diǎn)以及遺傳物質(zhì)的傳遞方式等。（ 2）受體：各種中間宿主與終宿主的遺傳背景，如遺傳物質(zhì)的傳遞方式 (包括人為的方法 )， DNA限制修飾系統(tǒng)， DNA重組基因特點(diǎn)，基因產(chǎn)物修飾系統(tǒng)，即轉(zhuǎn)錄與翻譯后修飾系統(tǒng)。如常用于基因工程的宿主菌 ，菌株不同，基因型亦不同，不同載體要求不同菌株。如： DH DH5α 、 E .coliDH5αF’ 1） 三者均有限制 修飾系統(tǒng)和重組基因缺陷，外源 DNA可存活，且不發(fā)生重組2） DH5α 和 DH5αF’ 都具有一個(gè)可供遺傳標(biāo)記 lacZα 檢測(cè)的遺傳背景3） DH5αF’ 可供 M13mp系列載體配套使用， M13病毒的感染需要 F’ 的存在3.實(shí)驗(yàn)性質(zhì)分子克隆的一般程序包括以下幾步： （ 1）分離供體 DNA或 RNA（ mRNA）和載體 DNA （ 2）構(gòu)建基因文庫或 cDNA文庫 （ 3）目的基因或 cDNA 克隆的篩選 （ 4）目的基因或 cDNA片段的鑒定：限制酶譜，次克隆，核苷酸序列分析，基因結(jié)構(gòu)分析等 （ 5）基因表達(dá)與調(diào)控機(jī)理的研究1) 建立文庫用載體 常在 進(jìn)行 小 — 質(zhì)粒載體，操作方便，鑒定簡(jiǎn)單 大 —λ 或 cos質(zhì)粒載體 , 甚至 pYAC載體 (為減少文庫規(guī)模，即使基因組小的也可用 λ 和 cos載體） ⅰ) 互補(bǔ)法：可表達(dá) ,選一般載體 。不表達(dá)，選表達(dá)載體 (外源基因必須表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物必須具備活性 ) ⅱ) 免疫法：與上同，但表達(dá)產(chǎn)物不一定具生物活性 ⅲ) 雜交法：各種載體均可2) 目的基因的鑒定 次克隆：選用質(zhì)粒載體，限制酶譜分析，基因結(jié)構(gòu)分析等 定序：定序載體（ M13mp系列），其他質(zhì)粒載體（如 pUC系列，pBR322， T3， T7， SP6啟動(dòng)子載體）3) 基因表達(dá)與調(diào)控 外源基因可表達(dá) — 普通載體 。 不表達(dá) — 表達(dá)型（分泌）載體 4. 載體容量 M13mp載體 4 kb 細(xì)菌質(zhì)粒載體 10kb λ 載體 23kb cos質(zhì)粒載體 48kb P1載體 95 kb pYAC載體 ∽1000 kb5. 合適的克隆位點(diǎn) 單克隆位點(diǎn)和多克隆位點(diǎn)演講完畢，謝謝觀看！