基因工程制藥-資料下載頁
2025-01-05 13:33本頁面
【正文】 菌的轉(zhuǎn)化率為 108，即每微克 pUC18中只有 108個分子能進入受體細(xì)胞。一微克 pUC18共有 1011個分子（ 1017 / 2686 660），即每 3400個 pUC18分子才有一個分子進入受體細(xì)胞 在實際操作過程中，轉(zhuǎn)化一微克 pUC18共需 2ml感受態(tài)細(xì)胞，大約含有 2 1010個大腸桿菌細(xì)胞，也就是說， 每 200個細(xì)胞只有一個細(xì)胞能接納 pUC18 DNA 。 （三）轉(zhuǎn)化率的用途 （四） 轉(zhuǎn)化率的影響因素 載體本身的性質(zhì)： 不同的載體轉(zhuǎn)化同一株受體細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率不同。 載體的空間構(gòu)象： 質(zhì)粒的 超螺旋 構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高，經(jīng)酶切連接后的載體由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，其轉(zhuǎn)化率要比新制備的質(zhì)粒低兩個數(shù)量級。 插入片段的大?。? 對質(zhì)粒載體而言， 插入片段越大 ， 轉(zhuǎn)化效率越低 受體細(xì)胞的性質(zhì)： 不同菌株轉(zhuǎn)化效率有較大差異 受體細(xì)胞與載體的匹配： 受體細(xì)胞必須與載體相匹配，如： pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM83株轉(zhuǎn)化率很低；但對大腸桿菌 ED8767株的轉(zhuǎn)化率則較高。 實驗參數(shù)條件方面： 實驗操作對轉(zhuǎn)化率影響較大，特別是電轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化電壓，電容，電阻等參數(shù)的設(shè)置非常重要。 四、增（重組基因的擴增） 增殖轉(zhuǎn)化細(xì)胞 擴增與表達載體上的標(biāo)記基因及目標(biāo)基因 表達外源基因 五、 檢（檢測轉(zhuǎn)化子，獲得重組子） 抗藥性檢測篩選法 顯色檢測 限制酶切圖譜檢測 PCR擴增檢測 原位雜交檢測 外源蛋白質(zhì)功能檢測 外源性 DNA插入到載體 DNA的某一抗藥性基因區(qū)域時，會導(dǎo)致抗藥基因的 失活 。轉(zhuǎn)化細(xì)胞就不能生長在含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)平板上。 抗藥性檢測篩選法 對于將外源 DNA插入 BamHⅠ 和 SalⅠ 之間位點 2. 顯色檢測 — β半乳糖苷酶篩選系統(tǒng)： IPTG可誘導(dǎo) LacZ基因片段編碼 β半乳糖苷酶氨基端片段 ,與宿主細(xì)胞所編碼的缺陷型 β半乳糖苷酶實現(xiàn)基因內(nèi)互補，又稱 α互補 。當(dāng)培養(yǎng)基中有 IPTG時，使含此質(zhì)粒的菌在 Xgal培養(yǎng)基上形成 藍(lán)色菌落 。 lacZ β 半乳糖苷酶 分解 半乳糖 i P O 調(diào)控蛋白 P 大腸桿菌的 β半乳糖苷酶基因 lacZ系統(tǒng) a互補顯色反應(yīng)（藍(lán)白斑篩選） lacZ β半乳糖苷酶 分解半乳糖 i P O 調(diào)控蛋白 P α肽段 分解 Xgal 產(chǎn)物呈現(xiàn)藍(lán)色 誘導(dǎo)劑 IPTG β半乳糖苷酶基因 lacZ突變體 M15 藍(lán) 白 篩選： 利用藍(lán)色化合物的形成作為 指示劑 ， 篩選帶重組質(zhì)粒的細(xì)菌 。 載體： 編碼 β 半乳糖 宿主： 編碼 β 半乳糖 苷酶 N端 序列 苷酶 C端 序列 α 互補 細(xì)菌表達： β 半乳糖苷酶活性 ↑ 5溴 4氯 3吲哚 （ Xgal） → 形成 藍(lán)色菌落 當(dāng)在質(zhì)粒中 插入外源 DNA→β 半乳糖苷酶的 N端基因失活 → 不能與宿主 β半乳糖苷酶的 C端 進行 α 互補 → 產(chǎn)生 白色菌落 。 （ IPTG 存在下 ） α 互補的檢測 IPTG：異丙基硫代半乳糖苷 誘導(dǎo)物 Xgal: 5溴 4氯 3吲哚 β半乳糖苷 ? 如果載體 DNA中含有 β半乳糖苷酶（ LacZ），那末，當(dāng)培養(yǎng)基含有 XGtal底物 + IPTG誘導(dǎo)物時，宿主細(xì)胞就會形成藍(lán)色菌落。（ 空載體 ） ? 如果在 LacZ基因區(qū)段插入外源性目的基因，就會造成 LacZ基因的失活，結(jié)果就不生成藍(lán)色菌落。 （ 重組子 ） 顯色篩選法實例 限制酶切圖譜檢測 限制性酶切圖譜法 就是對載體上插入的外源 DNA片段進行酶切圖譜分析，并以此與目的基因的已知圖譜對比 利用這種方法不僅能區(qū)分重組子與非重組子，而且還能鑒定目的重組子。是基因克隆最常用的檢測方法。 PCR擴增檢測 用 PCR的方法檢測是否插入外源基因片段。 抽提少量重組 DNA→PCR 擴增 → 電泳鑒定 →序列分析。 優(yōu)點：不需要合適的酶切位點。 缺點：假陽性高。 原位雜交檢測 根據(jù)插入 DNA片段的序列設(shè)計并合成 探針 ，以此搜尋篩選含有目的基因的目的重組子。 DNA同源序列之間的特異性互補雜交是該技術(shù)的基本理論依據(jù) 外源蛋白質(zhì)檢測 利用插入 DNA所表達的蛋白質(zhì)的 功能 或者 結(jié)構(gòu) 性質(zhì)，檢測外源蛋白質(zhì)的存在。適用于表達載體的檢測。 重組 DNA技術(shù)操作的主要步驟 載體 質(zhì)粒 噬菌體 病毒 目的基因（外源基因） 基因組 DNA cDNA 人工合成 PCR產(chǎn)物 限制酶消化 開環(huán)載體 DNA 目的基因 連接酶 重組體 轉(zhuǎn)化 體外包裝，轉(zhuǎn)染 帶重組體的宿主 篩選 表型篩選 酶切電泳鑒定 菌落原位雜交 謝謝觀看 /歡迎下載 BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAIT
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