基因工程制藥技術(shù)(已修改)
2025-01-09 07:10 本頁面
【正文】 第二章 基因工程制藥技術(shù)獲得目的基因 組建重組質(zhì)粒 構(gòu)建基因工程菌（或細胞）培養(yǎng)工程菌產(chǎn)物分離純化除菌過濾半成品檢定 成品檢定 包裝制備基因工程藥物的一般程序上游階段下游階段 基因 工程菌構(gòu)建流程一 表達載體構(gòu)建l表達載體設(shè)計l目標基因的定位克隆l酶切反應l連接反應l轉(zhuǎn)化l篩選與鑒定l表達載體概念： expressionvector在質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上，在多克隆位點處插入外源基因表達盒所構(gòu)成。l外源基因表達盒 (操縱子模型 )：目標基因 PCR定位克隆PCR循環(huán)PCR擴增的反應體系組成l模板 DNA：目標序列 ,100－ 10000bp,pgl引物：兩條寡核苷酸， 21～ 27bp。l脫氧核苷酸： 4種 dNTP,即dATP,dCTP,dGTP,dTTPlDNA聚合酶 :Taq聚合酶，耐高溫l緩沖溶液： 50mMKCl、 10mMTrisHCl,mMMgCl2 和連接反應限制性核酸內(nèi)切酶連接酶、 篩選與鑒定非轉(zhuǎn)化子：沒有導入外源 DNA的非轉(zhuǎn)化宿主細胞轉(zhuǎn)化子：導入外源 DNA的轉(zhuǎn)化細胞非重組子：僅含有空載體分子的轉(zhuǎn)化子重組子：含有重組 DNA分子的轉(zhuǎn)化子目標重組子：含有連接正確的重組分子（目的）非目標重組子：不含目的基因重組子轉(zhuǎn)化后的細胞類型篩選方法l將外源基因?qū)胨拗骷毎院?，首要任務是篩選含有目的基因的 陽性克隆并加以擴增。 所用的方法主要有遺傳學方法、免疫學方法、核酸雜交法、 PCR等。（ 1） 遺傳學方法? A. 抗生素篩選法? a. 單抗生素篩選? 大多數(shù)克隆載體帶有抗生素抗性基因，如氨芐青霉素（ ampicillin, Amp）、 四環(huán)素 (tetracycline,Tet)、 卡那霉素 (kanamycin, Kan)抗性基因。帶有完整抗生素基因的載體轉(zhuǎn)化宿主菌后，其宿主菌能在含有相應抗生素的瓊脂平板上生長。 ? b. 雙抗生素篩選雙抗生素篩選結(jié)果示意圖? B. 藍 白篩選（ α互補）? 許多載體（如 M13系列、 pUC系列、 pGEM系列）都含有β半乳糖苷酶基因（ lacZ） 的調(diào)控序列和氨基端 145個氨基酸的編碼序列。這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點。這種載體適用于可編碼 β半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主細胞。宿主和載體編碼的片段各自均無酶活性，但它們可以互補形成具有酶學活性的蛋白質(zhì)。這種現(xiàn)象稱為 α互補。因此，當載體的多克隆位點沒有插入外源 DNA片段時， α 互補能正常進行，產(chǎn)生有活性的 β 半乳糖苷酶。 能使人工底物 Xgal變成藍色 , 產(chǎn)生藍色菌斑或菌落。如果載體的多克隆位點插入了外源 DNA片段，導致產(chǎn)生無 α 互補能力的氨基端片段 , 帶重組體的細菌形成白色菌斑或菌落。（ 2） 免疫學方法? 如果克隆基因的產(chǎn)物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表達，因而可用相應的抗血清或單克隆抗體，通過放射免疫、化學發(fā)光或顯色反應進行篩選。（ 3） 核酸雜交法? 對菌斑或菌落進行原位分子雜交是從基因組文庫、 cDNA文庫或重組質(zhì)粒中篩選目的基因的最有效的方法之一，而且這種篩選不取決于目的基因是否表達。菌落原位雜交的原理 鑒定方法? 菌落 PCR： 是否 含有目標基因? 載體大小：電泳檢測? 酶切鑒定：插入 片段大小 及插入方向? 測序確證：目標基因的序列準確無誤，閱讀框架通讀二 基因工程菌的構(gòu)建? 基因工程菌： 微生物為操作對象，通過基因工程技術(shù)獲得的表達外源基因或過量或抑制表達自身基因的工程生物體。? 基因工程菌 種類：細菌和酵母是重要的表達重組藥物的制藥生物。細胞： G－，單細胞，桿狀。鞭毛，無芽孢，一般無莢膜。裂殖。菌落 :白色至黃白色，光滑，直徑 2－ 3mm。 大腸桿菌表達系統(tǒng)是 發(fā)展最早、應用最廣泛的經(jīng)典的表達系統(tǒng)優(yōu)點：? 遺傳背景清楚、目標基因表達水平高（高達 70％），培養(yǎng)周期短，抗污染能力強缺點：? 以包涵體形式表達的重組蛋白喪失了原有的生物活性? 不能用于加工修飾化（糖基化、酰胺化）蛋白表達? 細胞死亡后，細胞壁脂多糖游離出來，形成內(nèi)毒素，具有抗原性，產(chǎn)生熱 原基因工程大腸桿菌的應用 l 多肽類 2種（甲狀旁腺激素 (134)、利尿鈉肽）l 激素：胰島素及 2種突變體、 8種生長素 (1種 PEG化 )l 細胞因子類： 5種干擾素 α（ 1種 PEG化）、干擾素 β和 γ， 2種 GCSF(1種 PEG化 )，白介素 白介素 1白介素 1拮抗劑l 溶栓酶類： rPAl 白喉毒素 IL2融合蛋白、 OspA脂蛋白（疫苗）等PEG? 聚乙二醇（ PEG）是中性、無毒且具有獨特理化性質(zhì)和良好的生物相容性的高分子聚合物，也是經(jīng) FDA批準的極少數(shù)能作為體內(nèi)注射藥用的合成聚合物之一。? 具有高度的親水性，在水溶液中有較大的水動力學體積，并且沒有免疫原性。當藕聯(lián)到藥物分子或藥物表面時，能 防止腎小球濾過 減少免疫原性 阻止蛋白酶降解2.
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